【分析】西交大 李菲Small Methods：基于扫描电化学显微镜的热诱导下神经元氧化状态和氧化损伤水平的原位表征

保持一定体温是维持人体新陈代谢和正常生命活动的重要条件之一。随着全球气候变暖，高温不可避免地威胁人类生产生活和身体健康。中枢神经系统对热敏感，如长时间处于高热环境，中枢温度升高易发生神经系统损伤，甚至危及生命。神经元的氧化状态和代谢功能与其活性氧和耗氧量有关，如代谢活动的动态变化对大脑的可塑性和认知功能具有重要作用。在高温条件下，细胞的氧化-抗氧化平衡的改变影响神经元的生理过程，导致活性氧的过量产生，严重时可破坏线粒体呼吸链，进一步加重细胞的氧化损伤。因此，研究热诱导下神经元的氧化状态和氧化损伤对理解热相关神经元损伤的早期后果和机制非常重要。

原位监测神经元的呼吸活性、ROS水平和膜通透性这三个与细胞代谢和氧化还原状态密切相关的关键参数，可直接反映热相关的神经元氧化损伤情况。但以往由于缺乏可原位、无损、同时表征神经元多参数的方法，难以同时捕捉神经元的代谢和氧化还原状态相关多参数的动态变化。扫描电化学显微镜（scanning electrochemical microscopy，SECM）作为一种具有高时空分辨的无标记和非侵入式的微区电化学表征技术，应用电极探针实时原位记录细胞周围溶液中的氧化还原物质的电化学信号，可实现对活细胞的形貌成像、监测细胞释放的化学物质、表征细胞的氧化还原活性和代谢水平等。因此，SECM也可被用于对神经元的耗氧量、ROS水平和细胞膜通透性进行原位和无标记定量表征。

近日，西安交通大学生命科学与技术学院仿生工程与生物力学研究所（BEBC）李菲课题组构建了热诱导的体外神经元模型，应用SECM对人体体温范围内（37-42 ℃）热微环境下神经元的氧气消耗、胞外释放的H₂O₂水平和细胞膜通透性进行了原位、定量表征。同时研究了高温条件下（40-42℃）依达拉奉（一种临床常用脑保护剂和自由基清除剂）对神经元热应激产生的氧化损伤的保护作用（图1）。

图1. 应用温度控制的SECM平台原位表征热诱导下神经元的氧化状态和氧化损伤及EDA的作用效果示意图

该工作首先构建了热诱导的体外神经元模型（37-42 ℃），之后以细胞活力和细胞内ROS水平作为直接反映热诱导神经元细胞毒性和神经元氧化状态变化的两个关键参数，应用荧光表征技术研究了37-42 ℃下神经元的细胞存活率和细胞氧化应激的变化（图2）。结果发现，39-42 ℃培养的神经元呈现细胞毒性增加趋势，38-42 ℃培养的神经元细胞内有明显的ROS产生和积累，证实细胞活力随温度升高而下降，细胞内的ROS水平增加是热诱导神经元的早期表现。

图2.（A, B）神经元在37-42°C培养1小时后的细胞活力荧光图和统计图；（C, D）神经元内ROS水平的荧光图和荧光强度统计图

随后，分别选择氧气、H₂O₂和[Ru(NH₃)₆]Cl₃（一种亲水性的氧化还原电对）为SECM实验体系的氧化还原电对，通过记录SECM探针在扫描不同温度下的神经元过程中的三种电对的氧化或还原电流信息，原位表征了37-42 ℃下神经元的呼吸活性、细胞外H₂O₂水平和膜通透性（图3）。首先，以氧气和H₂O₂为氧化还原电对，应用SECM结合探针电极施加可编程脉冲波形电位，实现了对神经元呼吸活性和细胞外H₂O₂水平的同时追踪与电化学成像。结果表明在轻度热应激（38-40 ℃）下，神经元的氧化磷酸化和能量代谢未随ROS水平的升高而受到抑制，但当神经元面临严重的热应激（41-42 ℃）时细胞的呼吸活性下降，ROS生成持续增加，神经元线粒体的氧化磷酸化可能受到损害。

图3. （A）应用SECM对不同温度下神经元的耗氧量和细胞外H₂O₂水平表征的示意图；（B-G）神经元在37℃和37-42℃培养1小时前后的细胞呼吸活性和细胞外H₂O₂水平变化的SECM电流图像和细胞上方的氧气还原和H₂O₂氧化电流曲线对比图；（H, I）细胞上方的氧气还原和H₂O₂氧化电流差异统计图 

由于热应激导致细胞ROS水平的增加可能引起神经元的氧化损伤，进一步以[Ru(NH₃)₆]Cl₃为氧化还原指示剂，应用SECM纵深扫描模式原位表征了37-42 ℃培养下神经元的细胞膜通透性变化，结合COMSOL有限元模拟计算得到了膜通透系数P_m用以评估细胞膜的通透性（图4）。实验结果显示，神经元的细胞膜通透性从39 ℃开始逐渐增加，可能的原因是热应激下神经元产生的ROS攻击细胞膜脂质的碳-碳双键，导致膜的脂质过氧化，进而使细胞膜的通透性增加。

图4.（A）用于表征不同温度下神经元膜渗透性的纵深扫描模式SECM示意图；（B-G）37-42℃下培养1小时神经元的SECM纵深扫描图像和神经元中心上方SECM渐进曲线与理论渐进曲线拟合图；（H）37-42℃下培养神经元1小时后的平均P_m值随温度变化统计图

为进一步缓解热诱导神经元的氧化损伤，在神经元培养中加入了临床上常用的脑保护剂（也是一种自由基清除剂）——依达拉奉（EDA），应用SECM评估了EDA加入后对神经元在高热条件下（40-42 ℃）的保护作用（图5）。发现EDA作用后，神经元细胞外的H₂O₂水平与热诱导组（40-42 ℃）相比明显下降，膜通透性得到部分缓解，但40-42 ℃下神经元的呼吸活性与热诱导组相比没有明显改善，说明过高热可能通过其他机制导致神经元的细胞呼吸活性下降、膜脂质过氧化。

图5.（A）40-42℃培养的神经元加入EDA后细胞呼吸活性和细胞外H₂O₂水平变化的SECM图像和（B，C）细胞上方的氧气还原和H₂O₂氧化的电流曲线图；（D, E）40-42℃培养的神经元加入EDA后的SECM纵深扫描图像和细胞中心上方的SECM渐进曲线与理论渐进曲线拟合图；（F-H）有无EDA作用的神经元上方的氧气还原和H₂O₂氧化电流及P_m值变化的统计图 

为进一步研究40-42 ℃下热诱导神经元胞外H₂O₂水平和膜通透性升高的可能机制，基于Ca²⁺在神经元突触信号传递过程、膜兴奋性和细胞凋亡中的重要作用，用Fluo-4/AM对40-42 ℃下的神经元进行了Ca²⁺染色（图6）。结果显示，EDA作用后细胞内的Ca²⁺水平与对照组相比明显下降，但细胞内的Ca²⁺水平仍存在明显差异，由此推论细胞内的Ca²⁺超载可能是热诱导神经元损伤的一个不可忽视的因素。

图6. （A）加入EDA后神经元细胞内Ca²⁺水平的荧光图像；（B）EDA处理前后细胞内Ca²⁺水平荧光强度随温度变化的统计图 

该工作首次应用具有温度控制功能的SECM平台结合可编程脉冲电位和纵深扫描模式实现了对热诱导下神经元氧化状态和氧化损伤的原位、定量表征，研究结果有助于理解热相关的神经元的早期影响和损伤机制，也可为临床缓解热相关疾病提供神经元原位表征数据参考。文章第一作者是西安交通大学博士研究生张俊杰，通讯作者为西安交通大学李菲教授，其他作者还包括西安交通大学博士研究生刘禹霖、李亚北、朱彤、邱锦斌，西安交通大学徐峰教授和西安交通大学第一附属医院神经外科张华教授等。该工作也得到美国哈佛仪器公司Frank Wang博士在SECM仪器方面的帮助，以及国家自然科学基金、陕西省自然科学基金等项目的资助。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面）：

In situ and quantitatively imaging of heat-Induced oxidative state and oxidative damage of living neurons using scanning electrochemical microscopy

Junjie Zhang, Yulin Liu, Yabei Li, Tong Zhu, Jinbin Qiu, Feng Xu, Hua Zhang, Fei Li*

Small Methods, 2022, DOI: 10.1002/smtd.202200689

导师介绍

李菲教授课题组遵循“生命科学基础问题-电化学扫描探针显微镜平台研制-细胞原位电化学成像与表征”的学术思路，立足于电分析化学方法与技术，结合组织工程学、生物力学和细胞生物学等，开展疾病相关细胞物理微环境对细胞形态和化学等行为的原位电化学成像和细胞界面过程动力学研究，探究细胞微环境与细胞病理学的关系。

李菲

https://www.x-mol.com/university/faculty/13704

课题组主页链接

http://gr.xjtu.edu.cn/web/feili

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