清华陈春来/刘俊杰团队合作: 揭示 Cas12a 搜索靶点的分子机制
研究背景
CRISPR-Cas 系统是原核生物的适应性免疫系统，它可以帮助细菌或古细菌抵御外源病毒的入侵，基于组分和功能可以划分成两大类。
Cas12a 属于第二大类的第五类型，可在 crRNA 的引导下找到 PAM 序列为 TTTN 的靶标位点，通过 crRNA 与靶标链的互补配对实现对靶标双链 DNA 的特异性结合，并利用 RuvC 亚基切割双链 DNA 产生黏性末端，接着通过体内的 DNA 修复途径完成 DNA 的插入和删除等，执行基因编辑的功能。
此外，Cas12a 也可以与功能蛋白相融合实现碱基编辑、转录调控以及受光或者化学小分子调控的基因编辑。
对于所有的 Cas 蛋白和基于 Cas 蛋白的效应器来说，实现其功能的第一步是在基因组 DNA 链上众多的非特异性位点中找到正确的靶标位点。尽管有研究报道了 AsCas12a 利用三维和一维扩散的模式搜索靶点，但仍缺乏完善的结构基础和分子模型以阐释其靶标搜索这一动态过程。
该论文揭示了在生理盐浓度下，Cas12a 融合三维和一维扩散高效地搜索靶点，其 REC2 结构域中一段富含正电荷的 α 螺旋通过在搜索过程中与dsDNA的非特异性相互作用从而介导 AsCas12a、LbCas12a 和 FnCas12a 的一维扩散。此 α 螺旋也通过稳定 DNA 切割状态从而协助 AsCas12a 的靶标 DNA 的切割过程并影响 AsCas12 在体外和活细胞中靶标切割的特异性。这为优化和丰富多功能的 CRISPR-Cas 工具提供了一个新途径。
利用单分子荧光技术，该研究发现，不同种属来源的AsCas12a、LbCas12a和FnCas12a都采用围绕PAM位点的不对称一维扩散的方式找寻靶标位点（图 1a），这与spCas9蛋白的靶标搜索现象非常类似（Chem. Sci., 2021, 12, 12776-12784）。这表明除了PI（PAM-interacting）结构域，Cas12a还与PAM序列下游的DNA之间存在非特异性结合从而介导其不对称一维扩散。
通过蛋白突变，该研究发现蛋白 REC2 结构域中一段富含正电荷的 α 螺旋（AsCas12a 上的 400-415 位，LbCas12a 上的 380-391 位和 FnCas12a 上的 434-449 位的氨基酸残基）介导蛋白的一维扩散（图1b）。破坏该螺旋与双链 DNA 之间的非特异性相互作用会显著地削弱一维扩散的贡献，缩短搜索长度，并使其表观靶标搜索速率降低 10 倍左右。
另外，单分子FRET技术还揭示了 AsCas12a 上 400-415 位的 α 螺旋在 DNA 切割过程中还参与稳定非靶标链（NTS）以及靶标链（TS）的切割构象。将该区域内正电氨基酸残基突变为丙氨酸会降低 DNA 切割构象的稳定性，从而提高 AsCas12a 的切割特异性。而通过体外的 DNA 切割实验、体内的大肠杆菌以及 HEK293T 细胞的基因编辑实验均发现，调控 AsCas12a 以及 SpCas9 一维扩散的正电氨基酸的突变均可以提高蛋白 DNA 切割以及基因编辑的特异性（图1c）。
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最后，该研究提出了 Cas12a 搜索靶点的详细分子模型（图2）：溶液中自由扩散的 Cas12a/crRNA 复合物通过三维随机碰撞与 dsDNA 相互作用，一旦 REC2 结构域中富含正电荷的 α 螺旋与 dsDNA 非特异性相互作用，Cas12a 就会瞬时结合在 DNA 上并沿双螺旋进行短距离的一维扩散以寻找 PAM 位点。搜索到靶标位点后，PAM 的识别会导致 R-Loop 的形成和延伸，从而进一步引发RuvC结构域对NTS和TS的顺序切割。而对于 AsCas12a 来说，非特异性结合位点除了介导一维扩散外，还起着稳定 DNA 切割构象的功能，从而促进 DNA 的切割并影响蛋白基因编辑的特异性。我们的工作为改造 Cas 蛋白的靶标搜索和切割过程均提供了可与现有策略相兼容的全新思路。
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清华大学生命科学学院陈春来副教授为本文通讯作者；清华大学生命科学学院 17 级博士生孙瑞瑞为本文第一作者；生命科学学院已出站博士后赵玉倩，高级工程师王文娟以及清华大学生命科学学院刘俊杰研究员均参与了本项目研究。
本工作获得了北京结构生物学高精尖创新中心、北京市生物结构前沿研究中心、清华-北大生命科学联合中心及国家自然科学基金委的经费支持。
论文信息
Ruirui Sun, Yuqian Zhao, Wenjuan Wang, Jun-Jie Gogo Liu and Chunlai Chen*
https://doi.org/10.1039/D2SC05463A
通讯作者
清华大学生命科学学院
2003 年北京大学学士，2008 年获北京大学化学生物学博士学位，后前往美国宾夕法尼亚大学从事博士后研究，2015 年加入清华大学生命科学学院任特别研究员，2018 年任副教授，还担任北京市结构生物学高精尖创新中心和北京生物结构前沿研究中心 PI。先后主持面上、优青、地区合作等五项国家自然科学基金委项目。主要研究领域是：发展并利用单分子荧光技术，精准测量生物大分子的动态行为，从而在分子水平阐释其功能执行和调控机制，并在此基础上进行分子的改造和功能优化。相关工作以通讯作者发表在 PNAS、JACS、Angew Chem、Chem Sci、Nat. Commun. 等期刊。课题组相关论文链接
https://doi.org/10.1039/D1SC02633J https://doi.org/10.1016/j.isci.2019.08.005 https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.12.048
相关期刊
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Chem. Sci.
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Editor-in-Chief
Andrew Cooper
🇬🇧 利物浦大学
Associate editors
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* 2021 Journal Citation Reports (Clarivate, 2022)
† CiteScore 2021 by Elsevier
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