【规范与指南】线粒体糖尿病临床检验诊断专家共识
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文章来源：中华糖尿病杂志, 2021,13(9) : 846-851
作者：中国医师协会检验医师分会线粒体疾病检验医学专家委员会
单位：杭州医学院附属人民医院（浙江省人民医院）
摘要
线粒体糖尿病是由于线粒体功能缺陷引起的糖尿病，属于特殊类型糖尿病，约占糖尿病总数的3%。由于线粒体糖尿病存在临床表型异质性大、症状不典型、较为罕见等特点，常被漏诊或误诊为其他亚型糖尿病。线粒体糖尿病的临床治疗及随访不同于其他亚型糖尿病，因此，该亚型糖尿病的及早确诊将有助于患者后续的治疗与改善临床结局。本专家共识中对国内外有关线粒体糖尿病的研究成果与临床检验诊断策略进行总结，并提出线粒体糖尿病的临床检验诊断建议。
线粒体糖尿病（mitochondrial diabetes mellitus，MDM）是指由于线粒体功能缺陷引起的糖尿病，属于特殊类型糖尿病。MDM在诊断、治疗及后续管理上皆有别于其他类型糖尿病。目前国内尚缺乏针对MDM的诊断、治疗、患者管理、初筛以及转诊机制等相关的规范。随着生活水平的提高和新医改的深入推进，对糖尿病等慢性病的诊疗日益规范，预防和科学管理水平也日益提升。然而，受限于MDM的低发病率，临床医师尤其是基层医师对MDM的了解和认识不足，致使这部分患者极易在基层医疗机构被漏诊或误诊，甚至贻误病情，并且增加了后续的医疗费用。因此，为了提高各级医疗机构相关医务人员对MDM的认识水平，中国医师协会检验医师分会线粒体疾病检验医学专家委员会组织相关专家与糖尿病等相关疾病领域的临床专家就MDM的临床检验诊断展开多次讨论，一致认为目前有必要对MDM的临床检验诊断进行规范，以便有针对性地治疗。专家组依据国内外最新研究成果，结合我国实际情况，撰写了本版《线粒体糖尿病临床检验诊断专家共识》，随着对其基础和临床研究的深入及对其认知水平的提高，本共识将及时修订和更新。
概述
根据世界卫生组织在2016年发布的全球糖尿病报告，世界范围内成人糖尿病患者与1980年的1.08亿相比，2014年该数目已达到4.22亿，预计到2045年，成年糖尿病患者将增至6.3亿［1］。《中国2型糖尿病防治指南（2020年版）》的流行病学调查结果显示，我国的糖尿病患病率已高达11.2%［2］。MDM是指由于线粒体功能缺陷引起的糖尿病，属于特殊类型糖尿病，其中包括线粒体基因突变型糖尿病和核基因突变型糖尿病。就全球范围而言，MDM约占糖尿病总数的3%［3, 4, 5］。由线粒体基因突变引起的MDM占中国糖尿患者的0.6%~1.8%［2，6］，目前尚缺乏针对核基因突变引起的MDM在中国人群中的发病率数据。MDM临床上可表现为1型糖尿病或2型糖尿病（附录1），容易混淆，但其治疗方案确有区别于其他亚型糖尿病之处，即应尽早应用胰岛素，同时避免使用双胍类药物。MDM患者病程短，病程中较快出现胰岛β细胞分泌功能进行性减退。同时，MDM作为线粒体病的一种，具有可遗传性。
MDM早期精准诊断具有重大意义，包括：（1）临床医师可以给予有针对性的治疗；（2）对于其他临床并发症（如耳聋、神经肌肉病等）可尽早给予筛查及治疗；（3）对于其家系内的其他高风险成员予以遗传咨询指导，尽早进行筛查；（4）对于有生育要求的女性患者，可以基于产前诊断技术，如胚胎植入前检测，为其提供相应优生优育的指导。
MDM的病因及发病机制
线粒体作为真核细胞中普遍存在的细胞器，是机体的主要供能场所，提供全身约95%的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）［7］。当线粒体功能受损时，会累及多个组织器官，出现多系统疾病，线粒体病总体发病率约为1/5 000~1/2 000［8］，是罕见病中的常见病。功能受损的线粒体可造成胰岛素的分泌和利用障碍。
1.胰岛素分泌障碍或不足：在正常胰岛β细胞中，ATP增高可致ATP依赖的钾离子通道关闭，膜去极化，随后钙离子伴随ATP一起流入，诱导胰岛素囊泡的易位和胞吐，从而实现胰岛素的分泌与释放。而对于线粒体氧化磷酸化功能受损的胰岛β细胞，其ATP生成不足，导致钙离子通道的开放受到抑制，从而出现胰岛素分泌障碍［9, 10］；另外，活性氧（reactive oxygen species，ROS）可以诱导氧化应激和细胞凋亡，且胰岛β细胞中自由基解毒和氧化还原调节酶（如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等）较少，因此，胰岛β细胞对于ROS损害的耐受程度较其他哺乳动物细胞低。当线粒体功能异常时，ROS生成过多，导致细胞凋亡增多，使得胰岛β细胞绝对数量减少，因而造成胰岛素分泌不足［9］。
2.胰岛素抵抗：胰岛素抵抗是糖尿病发生、发展的重要原因之一。在胰岛素分泌的信号通路的上游，涉及到胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）和胰岛素受体底物2（insulin receptor substrate-2，IRS-2）的酪氨酸磷酸化修饰过程，当线粒体功能障碍时，损伤线粒体内高氧自由基浓度状态，会激活压力敏感的蛋白激酶，如JNK［11］、p38［12］和IKKB［13］，这些蛋白激酶会对IRS-1进行丝氨酸磷酸化和S-亚硝基化，同时会相应减少对IRS-1和IRS-2的酪氨酸磷酸化修饰，抑制胰岛素信号通路，这些负面作用将导致肝脏、骨骼肌和脂肪组织出现对胰岛素的抵抗［14］。
MDM的临床检验诊断
糖尿病的检验诊断已有成熟的指南及标准，本共识主要就已确诊为糖尿病的患者如何进一步筛查确定为MDM，提出检验诊断建议。
一、相关定义
对于满足以下3个条件的患者，可确诊为MDM；对于仅满足前两个条件的患者，无法确定糖尿病是否继发于线粒体功能缺陷时，建议给予糖尿病伴线粒体功能缺陷诊断。
1.糖尿病确诊患者。
2.经细胞功能学验证存在线粒体功能缺陷。
3.有明确的基因突变，含已报道突变及经细胞学功能验证的新突变，其中经细胞学功能验证的新突变详见后文注意事项的（1）~（4）。
二、MDM的筛查目标、对象及流程
MDM是指线粒体功能缺陷引起的糖尿病，因此需检测确诊糖尿病患者的线粒体功能是否出现缺陷，以进一步诊断MDM。
（一）MDM的筛查目标
通过对MDM疑诊患者的筛查，明确MDM的诊断，并确定其基因型，以指导后续临床治疗以及遗传咨询。
（二）MDM的筛查对象
结合《中国2型糖尿病防治指南（2020年版）》中相关内容［2］，结合卫生经济学考虑，本共识建议对评分≥4分的患者进行MDM筛查。评分项目如下：
1.发病年龄<40岁的2型糖尿病患者（1分）。
2.非肥胖体型的2型糖尿病患者（1分）。
3.胰岛相关抗体检测阴性（1分）。
4.伴神经性听力受损（1分）。
5.伴其他多系统临床表现，如中枢神经系统病变、心肌病、骨骼肌肌力减低、视网膜色素变性、眼外肌麻痹、乳酸酸中毒等（2分）。
6.病程短，病程中出现胰岛β细胞分泌功能进行性减退，较快出现口服药物失效而需胰岛素治疗者（2分）。
7.在家系内糖尿病的传递符合母系遗传（3分）。
（三）MDM的筛查流程
MDM的检验诊断策略是：先筛查线粒体基因组，从突变热点位点（如m.3243）着手，必要时进行线粒体基因组全序列检测。当线粒体基因组序列与修改后剑桥序列对比后未筛选出候选突变时，再考虑筛查核基因组的突变，必要时可通过细胞水平检测是否存在线粒体功能缺陷。
MDM推荐筛查流程图见图1。
图1 MDM推荐筛查流程图
1.线粒体基因突变型糖尿病的检验诊断：线粒体基因突变型糖尿病是线粒体基因突变所致的糖尿病。目前仅线粒体基因组已有20余个突变位点被报道与糖尿病相关（附录2），但m.3243A>G突变仍是MDM中最常见的突变位点，约占所有MDM的85%［15］，但目前尚缺乏针对中国人群的调查数据。因此，出现MDM临床疑诊患者时，仍应该首先筛查m.3243位点。建议在有条件的医疗机构内部搭建基于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术（推荐引物：Forward TAAGACTTCACC AGTCAAAGCGAACTAC；Reverse ATTGCGATTAGA ATGGGTACAATGAGG）和一代测序技术的m.3243A>G突变筛选平台，对符合条件的临床疑诊MDM患者进行筛查；对于不含m.3243A>G突变的MDM临床疑诊患者，可加强随访，或对部分有确诊需求的患者，做基于第二代测序技术或Long-range PCR并结合第一代测序技术的线粒体全基因组测序。对于以上使用一代测序技术筛查出携带已知突变位点（附录2）的患者，应进一步选择第二代测序、焦磷酸测序或微滴式数字PCR等技术进行分析，确定突变的异质性百分率并最终形成MDM基因诊断结果报告；对于筛查出携带未知突变的患者，可与科研机构合作进行进一步的细胞学功能验证分析突变的致病性，以做出确定或排除MDM的检验诊断。
2.核基因突变型糖尿病的检验诊断：对于线粒体基因检测未检出已公认的突变位点和已报道过的突变位点（附录2）的临床高度疑似MDM患者，若患者本人有进一步筛查的要求，建议其进行全外显子测序或全基因组测序对其核基因组进行突变筛查。对于筛查出已知的MDM相关核基因突变的糖尿病患者，可形成MDM基因诊断结果报告；对于筛查出未知核基因突变的糖尿病患者，需要做细胞学功能试验，验证其是否存在线粒体功能缺陷，必要时需要构建实验动物模型进行进一步功能验证试验［16］，分析该基因突变的致病性，以做出确定或排除MDM的检验诊断。
3.对于未检出突变基因的MDM疑诊患者：有条件的医疗单位（或与有成熟检测平台的科研机构合作）可对患者进行细胞学功能验证，若经细胞学功能验证存在线粒体功能缺陷的患者，可给予辅酶Q10［17］等改善线粒体功能药物对患者进行诊断性治疗并加强临床随访。
4.未出现典型糖尿病临床表型的线粒体病患者：临床医师或遗传医师（咨询师）应根据其突变基因型以及临床表型给予糖尿病筛查建议，尽量做到早发现、早治疗，以减少并发症的出现。
5.MDM高危亲属的筛查：对于未出现临床症状的MDM亲属，根据需要在临床医师或遗传医师（咨询师）的指导下进行相应的基因筛查或定时进行糖尿病筛查。
6.注意事项：（1）建议有条件的医疗机构对以下患者进行细胞学线粒体功能检测：①检测到新基因突变位点（未报道或未经功能验证），包括线粒体基因组和核基因组；②临床高度疑似MDM，但未检出明确的基因突变。
（2）在患者知情同意的情况下，细胞学线粒体功能检测首选皮肤组织（皮肤成纤维细胞），其次为血液（淋巴细胞）。
（3）标本留取：①血液样本：对于要进行测序的血液样本，可在收取样本后尽快进行DNA提取，DNA可长期保存于－20˚C以下的低温条件中；对于进行线粒体功能检测的血液样本，应常温下尽快分离出淋巴细胞（可诱导为永生化细胞系）并行功能检测。②皮肤组织：需常温下尽快进行细胞分离培养。对于上述提到的所有遗传学标本（如血液样本、组织样本等），机构应根据2019年3月20日公布的《中华人民共和国人类遗传资源管理条例》［18］进行采集、保藏、利用。
（4）细胞学线粒体功能检测［19］：主要包括线粒体氧化磷酸化复合体酶活性分析、线粒体氧耗能力测定、线粒体ATP生成能力测定等。
（5）所有基因检查结果应由临床医师、遗传医师（咨询师）等共同对其进行解读。
MDM有区别于其他亚型糖尿病的特殊性（如治疗方案、遗传特点和并发症等），尽早确诊MDM无疑对于调整治疗方案、提高患者生活质量、改善临床结局以及指导优生优育具有重要意义。然而，目前MDM的临床早期确诊率仍远远不够，但是随着高通量测序的发展、测序费用大幅降低、精准医学时代的来临，这将给MDM等遗传性疾病的精准诊断带来便利和机遇。
执笔者：楼筱婷（温州医科大学检验医学院）；方合志（温州医科大学检验医学院）；郑超（浙江大学医学院附属第二医院内分泌科）；武晓泓［杭州医学院附属人民医院（浙江省人民医院）内分泌科］
参与共识讨论的专家委员会成员名单（按照姓氏拼音排序）：白静（哈尔滨医科大学基础医学院）；毕艳（南京大学医学院附属鼓楼医院内分泌科）；曹颖平（福建医科大学附属协和医院检验科）；方方（首都医科大学附属北京儿童医院神经内科）；方合志（温州医科大学检验医学院）；傅启华（上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心）；谷卫（浙江大学医学院附属第二医院内分泌科）；侯新国（山东齐鲁医院内分泌科）；胡芳（中南大学湘雅二院内分泌科）；鞠少卿（南通大学附属医院检验医学中心）；李霞（中南大学湘雅二医院内分泌科）；励丽（宁波市第一医院内分泌科）；郦卫星［杭州医学院附属人民医院（浙江省人民医院）检验中心］；廖明媚（中南大学湘雅医院）；刘松梅（武汉大学中南医院医学检验科）；罗湘杭（中南大学湘雅医院内分泌科）；吕建新［杭州医学院附属人民医院（浙江省人民医院）检验中心］；宋质银（武汉大学生命科学学院）；武晓泓［杭州医学院附属人民医院（浙江省人民医院）内分泌科］；向代军（解放军总医院临床检验科）；谢而付（南京医科大学附属第一医院检验学部）；杨金奎（首都医科大学附属北京同仁医院内分泌科）；杨艳玲（北京大学附属第一医院儿科）；于景翠（哈尔滨医科大学附属第二医院科研中心）；张杰（四川省人民医院临床医学检验中心）；赵晓龙（上海市公共卫生临床中心内分泌科）；郑超（浙江大学医学院附属第二医院内分泌科）；郑宏庭（陆军军医大学新桥医院内分泌科）；周钦（重庆医科大学检验医学院）
参考文献略
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