病毒学国家重点实验室主任蓝柯|2020年中成果总结
关键词：宏基因组学/转录组学/空气动力学/气溶胶/微滴数字PCR/COVID-19
1.人物简介
蓝柯，生于1971年12月，武汉大学病毒学国家重点实验室主任、生命科学学院教授；担任中国病理生理学会肿瘤专业委员会常委、中国微生物学会病毒专业委员会委员、17届国际卡波氏肉瘤病毒大会主席、40-44届国际疱疹病毒大会学术委员会委员、美国微生物学会会员；同时兼任国际学术期刊Journal of Virology编委（Editorial Board Member）、Journal of Medical Virology副主编(Associate Editor)、Viruses编委（Editorial Board Member）、Science Bulletin副主编(Associate Editor)、Virologica Sinica副主编(Associate Editor)等；曾获得美国白血病和淋巴瘤学会特别研究员奖 (Special Fellow Award)、药明康德生命化学研究奖、明治乳业生命科学奖、上海市先进工作者等。在国际重要学术期刊Journal of Virology，PNAS，PLoS Pathogens，Cancer Research，Cell Host & Microbe等发表论文80余篇。致力于肿瘤病毒感染与致瘤的机制研究，利用具有潜伏特征的卡波氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）以及慢性持续性感染特征的乙型肝炎病毒（HBV）作为模式病原，深入研究病毒和宿主相互作用及感染致病机制，发展有效的抗病毒治疗策略。
2.工作履历
1994年毕业于重庆医科大学第二临床医学系并获医学学士学位；1998年于重庆医科大学获病理生理学硕士学位（师从范维珂教授）；2001年于中南大学湘雅医学院获病理生理学博士学位（师从中科院院士姚开泰教授），其后在美国宾夕法尼亚大学医学院微生物系从事肿瘤病毒学博士后研究（合作导师 Erle Robertson教授）；2006年8月受聘回国，任中科院上海巴斯德所研究员、博士生导师、研究组长，主要从事肿瘤疱疹病毒感染与致瘤机理研究；2008年入选上海市浦江人才计划；2009年入选新世纪百千万人才工程国家级人选，担任国家科技重大专项项目首席科学家；2011年获国务院政府特殊津贴；2011年-2016年担任中科院上海巴斯德所副所长、纪委书记；2017年1月起担任病毒学国家重点实验室主任、武汉大学生命科学学院教授、博士生导师；2013年主持国家自然科学基金重点项目；2014年获国家杰出青年科学基金资助；2015年入选科技部中青年科技创新领军人才，作为中国PI独立主持美国国立卫生研究院R01国际项目；2016年入选国家万人计划领军人才，主持承担多项国家级及国际合作项目，担任国家重点研发计划蛋白质机器专项项目首席科学家。
3.科研成就（2020年上半年重要成果总结）
（1）筛选鉴定小RNA病毒治疗的候选药物Emetine
January, 2020, Antiviral Research
“吐根町通过抑制病毒翻译保护小鼠免受肠道病毒感染”
Emetine, 吐根町，是一种有效的抗原生动物病药物和催吐剂。利用亚摩尼亚浸吐根与地下茎而提取的物质，是一种天然的催吐剂（Emetics）与去痰剂（Expectorant）。它通常用在意外的中毒中，也是最知名的催吐剂（Emetics）。吐根酊也用在镇咳去咳去痰液（cough mixture）中当作去痰剂（Expectorant）。而从18世纪到20世纪初期，吐根酊与鸦片用来制作糖浆形式的杜佛氏散（Dover's powder，或称吐根阿片散与复方吐根散）。近来证明可以抑制病毒聚合酶 (viral polymerases)，包括抑制寨卡病毒和埃博拉病毒感染。有效抑制自噬 (autophagy)，具有抗疟疾和抗阿米巴虫作用。
肠道病毒EV-A71是手足口病（HFMD）的主要病因。属小RNA病毒科，通常是轻度且自限性的，可引起发烧，手脚皮肤破损以及口腔中的囊泡。IRES (internal ribosome entry site, 内部核糖体进入位点) 驱动的翻译在小核糖核酸病毒感染中起重要作用。但是在动物模型中很少有针对这种途径的化合物具有有效保护的报道。我们鉴定了吐根町在RD（rhabdomyosarcoma，横纹肌肉瘤）细胞培养中可抑制EV-A71，EC50（half maximal effective concentration，半数最大有效/效应浓度）值为0.04μM，CC50 (半数最大细胞毒性浓度) 值为10μM。有趣的是，吐根町在纳摩尔水平上表现出针对一系列人类肠道病毒的活性，包括CV-A16，CV-B1，EV-D68，Echov-6等。在EV-A71小鼠模型中，每天两次以0.20 mg / kg口服给药时，吐根町可降低各种器官的病毒载量，并完全预防疾病和死亡。一项机理研究表明，吐根町可通过抑制病毒IRES驱动的翻译来抑制EV-A71。综上所述，这些数据表明吐根町是治疗微小RNA病毒感染的有前途的候选药物。
（2）宏基因组学视角下的新型人冠状病毒的鉴定
February, 2020, Emerging Microbes and Infections
“基于RNA的mNGS（宏基因组新一代/第二代测序）方法从2019年武汉爆发的两例肺炎病例中鉴定出一种新型人冠状病毒”
mNGS（metagenomic next-generation sequencing，宏/元基因组新一代测序），可直接将临床分离的原始样品或病原微生物进行测序分析。基于RNA的mNGS方法可以同时揭示生物体内存在的整个“感染组”（即RNA病毒，DNA病毒，细菌和真核生物），因为除了阮病毒以外的所有微生物组均表达RNA。此外，RNA测序超越了病原体的识别范围，可揭示有关病原体丰度，基因组序列和基因表达的相关数据，从而提供了对疾病原因的重要见解。
我们调查了两名与华南海鲜市场有独立接触史并发展了急性呼吸综合征的患者。两例患者共同的临床特征包括发热、咳嗽和双侧肺野多个磨玻璃混浊，并伴有斑片状浸润。在这里，我们强调使用低输入宏基因组新一代测序(MNGS)方法对从支气管肺泡灌洗液(BALF)中提取的RNA进行分析。它迅速鉴定了一种新的冠状病毒(根据世界卫生组织的公告命名为2019-nCOV)，它是样品中唯一的病原体，丰度水平很高(总RNA测序的1.5%和0.62%)。整个病毒基因组长度为29881nt (GenBank MN988668和MN988669，序列读取档案数据库生物条目登录PRJNA601736)，分类为β-冠状病毒属。系统发育分析表明，2019-nCOV接近Rhinolophus（马蹄蝠）家族的冠状病毒(CoVS)，如特别是RdRp部分序列同源性高达98.7%的蝙蝠冠状病毒BtCoV/4991株(GenBank KP876546，RDRP序列370nt，缺乏其他基因组序列)，与蝙蝠冠状病毒BAT-SL-CoVZC45和BAT-SL-CoVXC21同源性达到87.9%。基于OR F1a/1b、S和N基因的进化分析也表明，2019-NCOV更有可能是一种独立于动物向人类引入的新型CoV。
（3）液滴数字PCR/微滴数字PCR技术
“微滴数字PCR：一种更灵敏、更准确的SARS-CoV-2低病毒载量标本检测工具”
实时荧光定量PCR（RT-PCR）被广泛用作SARS-CoV-2临床检测的金标准。但是，由于患者喉咙的病毒载量低和RT-PCR的局限性，大量假阴性报告是不可避免的。我们探讨了液滴数字(droplet digital PCR，ddPCR）从57个临床咽拭子样本中检测SARS-CoV-2的可行性，并在敏感性和准确性方面与RT-PCR进行了比较。在57份样本中，这些样本均通过官方批准的临床RT-PCR检测被报告为阴性核酸，其中43份样本来自临床疑似发烧的疑似患者，还有14份样本来自假定康复期，这些病人即将在治疗后出院。实验是双盲的。结果：优化的ddPCR的检测下限至少比RT-PCR低500倍。ddPCR用于临床检测的总体准确性为94.3％。在后续调查中，通过ddPCR正确判断了RT-PCR检查的35例阴性咽拭子样本中的33份。此外，在RT-PCR中两次进行阴性核酸检测的14个假定恢复期样本，有9个（64.2％）通过ddPCR检测呈阳性。ddPCR在减少SARS-CoV-2的临床检测方面具有优势，可以减少假阴性，这可能是对现有标准RT-PCR的有力补充。在批准ddPCR进行诊断之前，目前的临床做法是合理且必要的，即将恢复期定义为出院后继续隔离2周。
数字PCR基于有限稀释，终点PCR和泊松统计的原理，绝对定量是其核心。它具有更宽的动态范围，没有外部干扰，并且对PCR效率的变化不敏感。2011年，Hindson基于传统的数字PCR技术开发了液滴数字PCR（ddPCR）技术。在该过程中，反应混合物可分为数以万计的纳米滴。这些巨大且高度一致的油滴。以低成本和实用的格式大大提高了数字PCR的检测动态范围和准确性。例如从临床样品中分析绝对病毒载量，分析基因拷贝数变异，罕见等位基因检测，基因表达，microRNA分析。近年来，该技术已被广泛使用于基因组编辑检测等。
我们建议dd PCR可以作为目前金标准RT-PCR的一种补充，以重新确认恢复期/康复期。这将有利于降低SARS-CoV-2疫情和社会恐慌的风险。
（4）转录组学研究
“COVID-19患者支气管肺泡灌洗液和外周血单核细胞的转录组学特征”
持续在中国和其他158个国家和地区中传播的COVID-19暴发造成了毁灭性的死亡，并对公共卫生构成了巨大威胁。但是，由于我们对这种致命疾病的宿主免疫反应的了解有限，阻碍了鉴定有效支持性治疗药物和治疗方法的努力。为了表征宿主对SARS-CoV-2（HCoV-19）感染的炎症反应的转录特征，我们对从COVID患者的支气管肺泡灌洗液（BALF）和外周血单核细胞（PBMC）标本中分离的RNA进行了转录组测序。我们的结果揭示了患者SARS-CoV-2感染的不同宿主炎症细胞因子谱，并突出了COVID-19发病机理与细胞因子过度释放（例如CCL2 / MCP-1，CXCL10 / IP-10，CCL3 / MIP-1A以及CCL4 / MIP1B）之间的关联。此外，SARS-CoV-2诱导淋巴细胞凋亡和P53信号通路的激活可能是患者淋巴细胞减少的原因。COVID-19患者的转录组数据集将为抗炎药物的临床指导和了解宿主反应的分子机制提供宝贵的资源。
病毒感染后细胞的转录组学分析对于鉴定宿主免疫反应动力学和基因调控网络非常有用。在这项研究中，我们使用RNA测序技术来调查COVID-19患者的BALF和PBMC标本中的转录变化。通过对这些数据集的转录组分析，我们确定了SARS-CoV-2感染诱导的多种免疫途径和促炎细胞因子，特别是BALF和CXCL10，TNFSF10，TIMP1中的CCL2，CXCL2，CCL8，CXCL1，IL33，CCL3L1 PBMC中的C5，IL18，AREG，NRG1，IL10，证明患者持续存在炎症和细胞因子风暴。PBMC转录组的KEGG通路分析表明，患者的淋巴细胞减少可能是由于淋巴细胞凋亡和P53信号通路的激活引起的。总之，我们的数据表明，SARS-CoV-2感染引起的细胞因子过度释放与肺组织损伤和COVID-19发病机理有关。
病毒性肺炎的炎症反应可能是一把双刃剑。尽管有益的炎症对于局部组织抵抗感染是必要的，但肺炎患者中炎症反应加剧会导致被称为“细胞因子风暴”的促炎细胞因子过度释放，从而导致有害结果，例如弥漫性肺泡损伤和纤维化，进行性呼吸衰竭和多器官功能障碍。此外，我们还发现在SARS-CoV-2病毒感染后还诱导了抗炎细胞因子IL-10和TGF-b，类似于在SARS患者中发现的高TGF-b活性。
尽管尚不清楚其潜在机制，但仍在大部分SARS和COVID-19患者中发现了淋巴细胞减少症。在SARS患者中几乎未检测到淋巴细胞的病毒感染。同样，我们尚未在患者的PBMC中观察到任何病毒基因表达，表明SARS-CoV-2病毒可能不会感染COVID-19患者的淋巴细胞。
SARS和COVID-19患者的淋巴细胞减少症更可能是由内源性或外源性糖皮质激素引起的，最终导致淋巴细胞凋亡，而不是直接感染这些细胞（讨论）。
（5）COVID-19气溶胶的空气动力学研究
“COVID-19爆发期间武汉医院SARS-CoV-2气溶胶的空气动力学特征和RNA浓度”
持续爆发的COVID-19已迅速传播，并引发了全球关注。尽管SARS-CoV-2通过人类呼吸道飞沫的传播以及与感染者的接触是明确的，但对SARS-CoV-2的气溶胶传播的研究很少。
在武汉大学人民医院和武昌方仓医院的患者区（PAA）和医务人员区（MSA）收集了三种不同类型的气溶胶样品（总悬浮颗粒，尺寸分离和沉积气溶胶）35份。COVID-19爆发期间位于中国武汉的医院（方仓）和公共区域（PUA）。加强型的液滴数字聚合酶链反应（ddPCR）方法用于定量病毒SARS-CoV-2 RNA基因组并确定气溶胶RNA浓度。
武汉大学人民医院的ICU（Intensive Care Unit, 重症监护室或重症加强护理病房，一般收治重症休克、严重水、电解质、渗透压、酸碱失衡患者、严重的多发伤、复复合伤患者等不分病种的病人），CCU（重症冠心病病房）和普通（general）病房，方仓医院的病房内的空气中SARS-CoV-2浓度均未检测到或较低，但武汉大学人民医院ICU的空气沉积物和方舱医院病区厕所的空气样品中的沉积物样品呈阳性。方仓医护区MSA中的SARS-CoV-2具有动态分布特点，在疫情爆发期间其浓度高于人民医院，但在患者人数减少和实施了严格的消毒后又变为负值。公共区域PUA具有无法检测的SARS-CoV-2浓度，但随着人群流量的增加而明显增加。
房间通风，开放空间，正确使用和消毒马桶可以有效地限制SARS-CoV-2的气溶胶传播。无症状携带者聚集在一起是SARS-CoV-2的潜在来源。病毒气溶胶在防护服或地板表面上的沉积及其随后的再悬浮是潜在的传播途径，有效的消毒措施对于最大程度地减少SARS-CoV-2的气溶胶传播至关重要。
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