中美团队提出新冠溯源新方法！病毒源头在印度次大陆

本文作者：华中农大CX 转载留言即可

2020年11月17日，来自中国科学院Libing Shen、复旦大学Funan He和美国得克萨斯大学的Zhao Zhang通过分析新冠病毒基因序列较低的突变概率，重新定义SARS-CoV-2系统进化树，提出SARS-CoV-2溯源新方法：

1. 根据简约原则，变异最小（least mutated strain, 最少突变株）的毒株应该是所有SARS-CoV-2的系统发育根/系统发育基础（phylogenetic root），故将最少突变株定义为病毒“根”。

2. 利用收集到的全球4571条SARS-CoV-2序列，重新划定出病毒分类子集并指出：印度次大陆最有可能是新冠病毒最早发生人与人之间传播的地点，且最早的病毒时间可以追溯到2019年的7月-8月。

相关研究发表在国际权威医学杂志Lancet旗下的预印本平台ssrn.com，题目为“The early cryptic transmission and evolution of SARS-CoV-2 in humanhosts”。部分成果已经经过同行评审发表在《分子系统发育与进化》上。

先看结论

根据编码区识别，实验人员将2019年12月至2020年7月间从人类宿主收集到的4571个SARS-CoV-2基因组序列分类为2449个病毒株（或病毒子集）。然而，科研人员分析后发现，在武汉首次鉴定的SARS-CoV-2 (NC_045512)毒株并不是最小的突变毒株。在我们的数据集中，有41个SARS-CoV-2毒株比NC_045512毒株具有更少的全局（全序列）点突变。

由于SARS-CoV-2的低突变性，在四大洲的八个国家中可以发现最小突变的毒株。在SARS-CoV-2的5个基因中发现了8个阳性选择位点，其中4个存在于SARS-CoV-2人对人传播的早期阶段。NC_045512菌株有2个阳性选择位点，一个在RNA依赖的RNA聚合酶(L314P)中，另一个在刺突蛋白(G614D)中。

对不同国家/地区SARS-CoV-2毒株多样性的统计分析表明，印度次大陆（Indian subcontinent）的毒株多样性最高。此外，根据SARS-CoV-2的突变率，研究人员推算最早的SARS-CoV-2在人类宿主中的传播可以追溯到2019年7月或8月。

研究人员的结果表明，武汉虽然是最早检测到病毒的地方，但并不是首次发生人传人的地方。SARS-CoV-2在传播到武汉之前，已经经历了人与人传播过程中的适应性进化。阳性选择位点有助于分析不同SARS-CoV-2毒株的不同临床特征。最小变异毒株的地理信息和毒株多样性都表明，印度次大陆可能是最早发生人与人之间SARS-CoV-2传播的地方，而时间上优先武汉爆发前三到四个月。我们的研究有助于阐明SARS-CoV-2在人类宿主中的早期神秘传播和进化，为COVID-19大流行的全球管理提供新的思路。

详细数据分析过程

研究人员发现，武汉首次鉴定的SARS-CoV-2基因组长度为29903个核苷酸。它的5’UTR有265个核苷酸，3’UTR有229个核苷酸。因此，其基因编码区有29409个核苷酸，几乎占总基因组的98.3。我们在最终比对中观察到3182个突变位点，每个SARS-CoV-2平均只有不到一个突变位点。而科研人员鉴定出的最大的毒株集含有318个SARS-CoV-2序列，而最小的毒株集只有一个序列。

值得注意的是，一个毒株集内的相同序列通常是从不同的日期和不同的国家或地区收集的。例如，NC_045512菌株可在五个国家发现，其收集日期为2019/12/30至2020/04/04。这一结果表明，SARS-CoV-2具有很低的突变性，能够长时间和远距离传播。

有趣的是，实验人员发现，武汉NC_045512毒株并不是最小的突变毒株。有41个菌株具有比它更少的全局点突变。突变最小的菌株有15552个全局点突变，而NC_045512的菌株有18421个全局点突变。突变最小的菌株收集来自孟加拉国，美国，希腊，澳大利亚，印度，意大利，捷克共和国，俄罗斯和塞尔维亚，收集日期为2020/03/01至2020/06/12。科研人员假设最小突变毒株没有突变，其余2448株SARS-CoV-2菌株共有15552个总点突变，每个毒株平均有6.35个点突变。

基于简约原则，突变数量最少的毒株应该是基础类群。在系统发育树中，科研人员首先重建了4571个SARS-CoV-2序列的系统发育树，并在其上标记了42个最少的突变毒株。结果发现，一半以上的较少突变毒株非常接近最小突变菌株（0001），而NC_045512毒株（0042）与其他较少突变菌株相距较远。据较少突变毒株的分布表明，毒株0001比毒株0042更有可能是树的根。

由于SARS-CoV-2是一种突变率很低的病毒，因此在武汉首次鉴定的SARS-CoV-2基因组序列不可能是其他SARS-CoV-2的祖先，这排除了人类对人类SARS-CoV-2传播首先发生在中国武汉市的可能性。

研究人员指出，病毒传播通常伴随着积极（或正向）的选择事件（positive selection），这有助于病毒在不同宿主之间跳跃或帮助其适应新的宿主群体。因此，实验人员在Orf1ab1，Orflab2，刺突(S)，Orf3a和核衣壳(N)基因中共检测到8个阳性选择位点。其中4个阳性选择位点已经出现在42个较少突变的毒株中，它们是SARS-CoV-2在人类宿主中传播的早期阶段的缩影。进一步的系统发育分析表明，Orf1ab1和Orf3a中的阳性选择事件在地理上主要存在于与美国相关的菌株中，而Orflab2中的阳性选择事件存在于欧洲毒株中。而在S蛋白中的G614D突变在菌株0042（中国武汉)和菌株0008(美国加利福尼亚州)中是反复且独立出现的。CODEML结果表明，即使在42个较少突变的毒株中614D也表现出微弱的正向选择信号，且P值并不显著。

总结

不难发现，由系统发育分析与突变谱相结合认为，武汉市首次鉴定的SARS-CoV-2毒株极不可能成为所有SARS-CoV-2的祖先。根据简约原则，变异最小的菌株应该是所有SARS-CoV-2的祖先。在澳大利亚、孟加拉国、希腊、美国、俄罗斯（塞尔维亚）、意大利、印度和捷克共和国等八个国家都可以找到这一最小突变。理论上，他们中的任何一个都可能是变异最少的毒株的诞生地。SARS-CoV-2由于其低突变性，能够在长时间和广范围的传播后保持其基因组完整性。由于单一/单纯的系统发育分析无法为SARS-CoV-2的起源提供线索，一个常识是病毒的发源地通常有很高的病毒株多样性。

在本研究中，实验人员共收集到来自分布2449个毒株集的SARS-CoV-2基因组序列4571个。而美国SARS-CoV-2序列的百分比为71.13%（3297/4571），经最小突变分类后美国SARS-CoV-2毒株的百分比为66.6% (1631/2449)。美国的SARS-CoV-2序列的百分比远远高于它在我们分类数据集中的SARS-CoV-2菌株的百分比，这是病毒株多样性低的标志。在印度和孟加拉国，统计结果表明，这两个国家的病毒株分集率远高于序列占比，这是病毒株多样性高的标志。印度和孟加拉国都位于印度次大陆。沙特阿拉伯具有相对较高的突变多样性，在地理上也接近印度次大陆，就在阿拉伯海对面。

以上证据表明，SARS-CoV-2具有很低的突变性，并且在印度和孟加拉国都可以发现最小的突变毒株，科研人员很自然的提出，最早的人与人之间的SARS-CoV-2传播可能发生在印度次大陆。

那么，最早的人对人SARS-CoV-2传播日期是什么时候呢？研究人员指出，根据病毒突变率，SARS-CoV-2每年在其基因编码区累积约11.41个点突变。突变最少的菌株与NC_045512菌株之间存在三个核苷酸差异，那么，两个菌株之间产生分歧的时间约为三或四个月（每月0.951点突变推算）。自第一位SARS-CoV-2患者于2019年12月12日在武汉市住院以来，考虑到SARS-CoV-2具有潜伏期 2天-14天-23天不等的时间分布，武汉的SARS-CoV-2隐性传播必定于2019年11月中或下旬开始。因此，最早的或病毒源头的人对人SARS-CoV-2传播可追溯至2019年7月或8月。

参考：

This preprint research paper has not been peerreviewed. Electronic copy available at: https://ssrn.com/abstract=3724275

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