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一网打尽:冠状病毒家族治疗靶点首次被确定

病毒学 生命科学前沿 2021-03-17

本文作者:Karwai  转载留言即可

冠状病毒科是导致人类疾病的一大病毒家族,目前已发现了7种已知的人类病原体,但至今却没有一款获得批准的疫苗上市,治疗选择也十分有限。季节性循环的人类冠状病毒(HCoV) OC43HKU1229ENL63可引起人类轻微的、普通的类感冒呼吸道感染。然而SARS-CoV-1MERS-CoV可导致急性呼吸窘迫综合征和死亡,死亡率在10-40%之间。SARS-CoV-2虽然没有那么致命,但比前两者传播能力强得多。由于SARS-CoV-2和其他冠状病毒对全球健康的严重影响,因此了解它们在感染期间如何劫持宿主细胞机制并应用这一知识开发新的治疗策略至关重要。

2020年12月8日,Cell杂志在线发表了一篇来自Ruofan Wang等人的研究成果:Genetic screens identify host factors for SARS-CoV-2 and common cold coronaviruses,本研究使用的正交策略(筛选突变),在人类细胞中使用进行了全基因组CRISPR敲除(KO)筛选(CRISPR screen)。通过对感染SARS-CoV-2和两种季节性循环的普通感冒冠状病毒OC43229E的细胞进行筛查,最终揭示了宿主途径、病毒-宿主相互作用的新方面,并确定了宿主导向的抗病毒治疗靶点

重要的是,研究人员还将功能基因组学的方法扩展到与人类距离较远的冠状病毒科成员,以探索病毒家族之间的共性和差异

主要内容

当冠状病毒与人类细胞结合并发生膜融合时,特定的细胞蛋白质会被病毒劫持,并在病毒生命周期中发挥关键作用。例如,血管紧张素转换酶2 (ACE2)被用作NL63、SARS-CoV-1和SARS-CoV-2的病毒进入受体。此外,细胞蛋白酶,如TMPRSS2、组织蛋白酶L和furin对于裂解几种冠状病毒的病毒S蛋白促进膜融合也十分重要。

之前的研究虽然已经系统阐明了病毒生命周期后期病毒-宿主的相互作用,揭示了病毒和细胞蛋白质之间的物理关系,但它们并没有提供关于这些宿主成分对病毒复制重要性的即时信息。

而在该研究中,研究人员利用CRISPR Screen这种方法,正确地筛选出了三种冠状病毒独特的病毒进入因子:ACE2(用于SARS-CoV-2)氨肽酶N(用于229E)糖胺聚糖(用于OC43)

此外,研究确定磷脂酰肌醇磷酸盐生物合成胆固醇稳态是支持三种冠状病毒感染的关键宿主途径。磷脂酰肌醇激酶和胆固醇稳态的药理学作用也抑制降低了以上三种冠状病毒的复制。相反,在SARS-CoV-2感染中,溶酶体蛋白TMEM106B似乎是唯一只被SARS-CoV-2识别的

SARS-CoV-2需要细胞胆固醇才能有效进入

该研究中的药理实验表明,SARS-CoV-2需要细胞胆固醇才能有效进入。这一观察结果也得到了其他研究对保护SARS-CoV-2感染的干扰素刺激基因筛选的支持,这些筛选发现胆固醇25-羟化酶(CH25H)是最热门的基因之一。

值得一提的是,之前的研究表明,布尼亚病毒和汉坦病毒感染时,胆固醇稳态也与这些病毒进入和膜融合有关,这也提示了不同病毒家族一些共同的前病毒功能

磷脂酰肌醇生物合成是冠状病毒感染的一个重要途径

研究人员发现PI3K复合物是一个新的关键宿主因子,可能具有泛冠状病毒功能。由于冠状病毒参与了包括囊泡运输和自噬在内的多个细胞过程,因此尚不清楚冠状病毒是否在进入和/或病毒复制/转录复合物所需的双膜囊泡生成过程中劫持了PI3K通路。

值得一提的是,在一些对药物筛选在利用的研究中,研究人员鉴定了大约100种抑制SARS-CoV-2复制的化合物。值得注意的是,其中有PIKfyve抑制剂蛋白酶抑制剂胆固醇稳态调节剂。因此,该研究功能基因组数据表明,这些化合物的观察效果可能是由于抑制关键宿主因子。

其他研究忽略了许多重要的宿主因子

研究人员认为,之所以其他类似的研究忽略了许多至关重要宿主因子,可能是由于选择的实验系统不同

Wei等人对非洲绿猴细胞系VeroE6进行了全基因组CRISPR筛选。除了真正的进入因子ACE2和组织蛋白酶L,筛选结果大量显示了染色质修饰因子,如HMGB1和SWI/SNF染色质重塑复合体。前者被证明可以调节ACE2的转录,从而间接调节VeroE6对SARS-CoV-2感染的敏感性。在人类细胞中进行的任何CRISPR筛查中,HMGB1均未显著富集,这表明受体表达水平的调控可能与物种或细胞类型有关

Daniloski等和Zhu等在A549-ACE2细胞中进行了筛选。两项研究都鉴定了ACE2、组织蛋白酶L和与核内体酸化(例如V-ATPase的亚基)或核内体蛋白分类和循环相关的基因。后者被证明对ACE2细胞的表面表达至关重要,因此可能间接影响病毒的进入。

有新的证据表明,SARS-CoV-2可以通过不同的途径进入,这取决于靶细胞上TMPRSS2的水平以及病毒刺突蛋白多碱性S1/S2位点的突变

SARS-CoV-2 S蛋白的裂解可以通过TMPRSS2发生在质膜上,也可以通过组织蛋白酶发生在内溶酶体上。因此,足够的TMPRSS2水平可能会减少对组织蛋白酶和其他与内溶酶体活性相关的因素的需求,该研究的筛选支持了这一假设,该筛选是在TMPRSS2过表达的背景下进行的,并没有发现组织蛋白酶是关键的宿主因子。

相比之下,A549和VeroE6细胞不表达可检测到的TMPRSS2水平,因此病毒可能会优先依赖组织蛋白进入这些细胞,这是在这些细胞中筛选的结果。而作为SARS-CoV-2天然靶细胞的鼻、肺上皮细胞可表达高水平TMPRSS2

总之,研究展示了在TMPRSS2阳性遗传背景下进行的宿主因子筛选。因此,它揭示了对SARS-CoV-2感染至关重要的宿主因子,这些宿主因子可能比迄今为止在其他遗传背景中发现的宿主因子更具生理相关性

此外,研究比较筛查突出了SARS-CoV-2与普通感冒冠状病毒OC43和229E之间的共性和差异。特别地,这种比较表明可识别PI3K复合物胆固醇稳态作为今后的抗病毒治疗目标,以寻求发展宿主导向的全血细胞病毒治疗。

CRISPR Screen:病毒-宿主互作研究神器

近几年,随着CRISPR-Cas基因编辑技术的兴起,各种CRSIPR的应用领域也逐渐拓宽,被广泛地应用于基因敲除、敲入,DNA甲基化,转录激活、抑制,组蛋白修饰以及全基因组筛选等领域。而所谓的CRISPR Screen便是基于CRISPR-Cas9技术,设计成千上万个sgRNA, 在全基因组范围内进行基因编辑实验,筛选出大量突变细胞,识别与特定表型相关的基因。

在病毒-宿主互作研究领域,基于CRISPR Screen技术的宿主全基因组sgRNA文库高通量筛选平台,可快速发现参与病毒侵入、复制等生物学过程的关键宿主因子,进而明确病毒-宿主分子相互作用进而揭示病毒的生命周期,可为病毒-宿主相互作用的研究提供十分强大的研究工具。

例如:2018年5月Nature杂志发表了来自美国圣路易斯华盛顿大学医学院的Diamond教授的研究:Mxra8 is a receptor for multiple arthritogenic alphaviruses。该研究利用CRISPR Screen技术对人类细胞进行全基因组水平筛选,鉴定并证明了基质重塑相关蛋白8(Matrix Remodeling Associated 8, MXRA 8)是基孔肯雅病毒等致关节炎类甲病毒的一种哺乳细胞侵入受体。

2019年5月16日,Cell杂志发表了来自中国科学院微生物研究所高福团队与北京大学魏文胜团队,首都医科大学附属北京儿童医院谢正德团队联合研究的文章:Human neonatal Fc receptor is the cellular uncoating receptor for Enterovirus B。该研究利用CRISPR Screen技术,发现人类新生儿Fc受体(FcRn)是多个B族肠道病毒的通用脱衣壳受体,并通过解析病毒与其吸附受体和脱衣壳受体的电镜结构,阐明了肠道病毒感染宿主细胞的入侵机制。该成果在B族肠道病毒的药物开发和致病研究,非囊膜病毒的入侵机制方面均具有重要意义。

总而言之,随着CRISPR Screen技术越来越多地应用于病毒-宿主互作领域的研究,为理解病毒的生命周期和开发宿主导向的治疗药物提供了重要的见解!另外,利用这一策略也可以揭示潜在的泛冠状病毒或其他病毒家族的通用宿主因子,从而阐明抗病毒治疗的靶点,以对抗当前和未来可能爆发的疫情。


参考文献

[1] R. Zhang, A.S. Kim, J.M. Fox, S. Nair, K. Basore, W.B. Klimstra, R. Rimkunas, R.H. Fong, H. Lin, S. Poddar, J.E. Crowe, Jr., B.J. Doranz, D.H. Fremont, M.S. Diamond, Mxra8 is a receptor for multiple arthritogenic alphaviruses, Nature 557(7706) (2018) 570-574.

[2] H. Song, Z. Zhao, Y. Chai, X. Jin, C. Li, F. Yuan, S. Liu, Z. Gao, H. Wang, J. Song, L. Vazquez, Y. Zhang, S. Tan, C.M. Morel, J. Yan, Y. Shi, J. Qi, F. Gao, G.F. Gao, Molecular Basis of Arthritogenic Alphavirus Receptor MXRA8 Binding to Chikungunya Virus Envelope Protein, Cell 177(7) (2019) 1714-1724.e12.

[3] Wang, R., Simoneau, C.R., Kulsuptrakul, J., Genetic  screens identify host factors for SARS-CoV-2 and common cold coronaviruses, Cell (2021), doi: https:// doi.org/10.1016/j.cell.2020.12.004.


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