【成功案例】百迈客转录组测序助力抗癌免疫网络研究
英文题目：RNA-Seq analysis of interferon inducible p204-mediated network in anti-tumor immunity
中文题目：RNA-Seq分析干扰素可诱导的p204介导的抗肿瘤免疫网络
发表杂志：Scientific Reports
影响因子：4.259
合作单位：山东大学生命科学学院山东省动物细胞与发育生物学重点实验室
研究背景
01
干扰素可诱导的p204，由Ifi204基因编码产生，是p200蛋白家族成员之一，被认为是先天免疫应答的重要分子。p200蛋白家族包括一系列干扰素诱导蛋白，具有高度结构同源性，如在小鼠中表达的p202a、p202b、p203、p204、p205等，人类中表达的IFI16、MNDA、AIM2和IFIX等。p200家族成员被IFN刺激的应答反应所诱导；在干扰素处理后，p200家族基因座被转录激活，并且在髓系细胞中的表达被IFN-γ显著诱导，说明p200蛋白在先天免疫中起重要作用。p204的人类同源蛋白IFI16通过直接识别双链DNA片段来作为DNA传感器，并被证明在对疱疹病毒感染的先天免疫中起着至关重要的作用。最近研究表明Ifi204可以直接与TLR4结合，对于典型的LPS-TLR4信号通路激活至关重要。因此，Ifi204在对病毒和细菌的先天免疫中起重要作用。
此外，IFI16对于人类免疫缺陷病毒（HIV）感染的CD4+ T细胞死亡至关重要。p204和环-GMP-AMP合成酶（cGAS）互作以感知细胞内弗朗西斯氏菌属感染，并触发IFN-γ的表达。因此，p200家族成员在病毒和细菌DNA识别以及由此引发抗病原应答中发挥关键作用。p200家族成员已被报道与多种自身免疫性疾病有关，包括干燥综合征（SjS）、系统性红斑狼疮（SLE）、系统性硬化症（SSc）和风湿性关节炎（RA）等。研究表明，p204除了能调节先天免疫外，也是细胞分化的重要调节因子，并且可以通过多种机制在细胞周期调控中发挥抗增殖作用。因此，p204被认为是一种重要的肿瘤抑制基因。然而，由于Ifi204敲除（KO）小鼠较难获得，所以p204介导的体内抗肿瘤反应的潜在分子机制尚不清楚。
在这篇文章中，作者第一次展示了从Ifi204缺失小鼠中收集的数据。为了研究p204介导的抗肿瘤应答网络，作者在野生型（WT）和p204 KO小鼠中诱导了Lewis肺癌（LLC）模型，并通过RNA-seq确定了基因表达水平的变化及相关的通路和途径。
研究方法
02
利用Cre/loxP重组系统获得条件敲除小鼠，再经过一系列杂交、回交方法获得Ifi204−/−（KO）小鼠和遗传背景一致的IfI204+/+（WT）小鼠。
8周龄WT和Ifi204 KO雄性小鼠注射Lewis肺癌细胞作为实验组（crt），对照组（exp）注射PBS。
小鼠在肿瘤细胞植入28天后处死，收集脾脏进行RNA-Seq。
技术路线如下：
研究结果
03
1. RNA-Seq数据总览
总测序数据量为30.02 Gb clean data，在参考基因组上的比对效率在90%以上，其中约75% read比对到外显子上。用FPKM值对各个样本中的基因表达水平进行定量，并基于此进行样本间相关性分析（图1A），结果表明组内生物学重复间的相关性系数在0.96以上，生物学重复间相关性较好。之后根据基因在样本中的表达量，基于FC与FDR值筛选组间差异基因（图1B）。
2. 对照组p204 KO小鼠中差异表达的基因及其功能
所有组间的差异基因共有4000个，其中对照组p204 KO小鼠与对照组WT小鼠相比，有11个DEG，其中6个上调，5个下调（表1）。两组间差异基因数目较少，说明p204可能并不是平衡状态下主要生理功能所必需的。6个上调的基因中，包含一个p200家族成员-- p202，其基因表达量显著提高可能代表着p204缺失事件的补偿作用（表2）。但是另外两个p200家族成员-- p205和类p204蛋白（Pydc3）的基因表达量显著降低（表2）。因为染色体上这些基因的位点与Ifi204基因非常接近，所以p205和Pydc3的表达量降低可能是由于Ifi204基因的缺失影响了这两个基因的转录。一种增强自然杀伤（NK）细胞毒性的蛋白编码基因—ERDR1在p204 KO小鼠中表达量降低，说明p204可能在NK细胞介导的抗肿瘤免疫中起重要作用。
3. 荷瘤IFI204 KO小鼠中差异表达的基因及其功能
3个WT和3个p204 KO荷瘤小鼠（exp组）间共有393个差异表达基因，其中303个基因上调，90个基因下调（表1）。基因表达量热图分析结果表明，组内三个样本的基因的表达模式非常相似（图2A）。DEG GO功能注释结果表明，DEG注释到了细胞外基质、抗氧化活性、化学引诱活性、多组织过程、免疫过程、粘附、细胞杀伤活性等功能分类中（图2B）。
与对照组相一致，p204 KO荷瘤小鼠中p200家族成员也明显受到影响。p202表达水平被显著诱导，而p205b、Pydc3和IfIT1表达水平降低。实验和对照组中p200家族成员表达变化的一致性表明了实验过程和生物信息学分析的有效性。除了p200家族成员，还有细胞因子及其受体，包括IL-17RB、IL-36ᵞ和type 2 IL-1R、IL-27、IL-18R和IL-3R也受到了显著影响。如变化最显著的IL17RB表达量增加了8倍，它是IL-17B和IL17E (IL-25)的受体，其结合互作对辅助性T2细胞（Th2）的免疫应答至关重要 。ILI7RB的强烈应答感应表明p204可能是调节Th2免疫反应的重要因子。IL-1家族成员IL-1R2、IL-18R和IL-36也被显著诱导，说明p204也是炎症的重要调节因子。此外，一些趋化因子受体和白细胞粘附分子（如CXCR1、CXCR2、CCR1）以及整合素分子和c型凝集素，均表达量上调，可能会促进p204 KO小鼠肿瘤的生长和转移。如图3所示，在p204 KO小鼠中CXC亚族和CC亚族的趋化因子、IL-3RB受体、IL-17家族和IL-1家族成员受到的诱导作用非常显著。这些数据表明，与WT小鼠相比，荷瘤p204 KO小鼠的炎症可能加重。
为了了解p204介导的途径，对DEG进行了KEGG通路、GO富集分析。在每一个试验组和对照组之间，总共有150条通路富集，很大一部分DEG参与了细胞因子-受体互作、癌症相关通路、血细胞凋亡、白细胞转移和吞噬通路（图4）。topGO富集分析结果表明，受p204缺陷影响的大部分DEG富集在ATP结合、蛋白结合、锌离子结合、蛋白同源二聚化、相同蛋白结合、蛋白质结构域特异性结合、蛋白激酶结合、蛋白质复合物结合等功能中。因此，p204可能是多种细胞事件的关键信号分子，例如蛋白二聚化和蛋白复合物的形成。
小结
04
本次研究中，作者以第一次报道的p204 KO小鼠为材料，获得了p204缺失的Lewis肺癌（LLC）小鼠模型，利用高通量RNA-Seq研究了Lewis肺癌模型下p204介导的基因表达谱和信号网络。结果显示，未处理的p204 KO小鼠与未处理的WT小鼠相比，只有11个基因表达量发生了变化，而荷瘤p204 KO小鼠与荷瘤WT小鼠相比，有393个基因表达量发生了变化。进一步的差异表达基因聚类和GO分类，表明p204对趋化性、细胞迁移及细胞因子表达有显著影响。作者的发现不仅支持了先前关于p204在感染中的作用的研究，并指出p204可能在抗肿瘤免疫中也发挥了重要作用。此研究为未来研究p204及其人类同源蛋白IFI16在抗肿瘤免疫反应中的作用提供了研究框架，并提供了关于p204在细胞信号级联、炎症和激素分泌方面的其它功能的新证据。总的来说，这些发现揭示了p204未来生物学研究的潜在方向。
参考文献：
Jinlong Jian, Wei Wei, Guowei Yin, et al. RNA-Seq analysis of interferon inducible p204-mediated network in anti-tumor immunity[J]. Scientific Reports. Published online: 24 April 2018.
延伸阅读