【文献精读】用于循环外泌体小RNA表达谱分析的商业化外泌体分离试剂盒比较

循环外泌体小RNA（miRNA）是有价值的生物标志物候选分子，有一个根本性问题未得到满意的解决，即外泌体分离的技术标准化，外泌体分离是精确检测外泌体miRNA的关键步骤。目前已经有多种方法来分离外泌体，包括超速离心（ultracentrifugation，UC）、尺寸排阻色谱法（size exclusion chromatography，SEC）、超滤、免疫亲和分离、微流体技术和聚合物沉淀法。

以往有研究团队对不同的外泌体分离方法进行了比较研究：

迄今为止，对这些试剂盒的定量和定性表现的比较分析很少有报道。本研究中作者严谨地比较了常用的3种外泌体分离商业化试剂盒和1种血浆/血清外泌体RNA提取试剂盒，并分析了每种试剂盒的优缺点及其在血清和/或血浆样品中的应用。

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3种外泌体分离试剂盒分离外泌体而后用Trizol提取外泌体RNA，试剂盒如下：

Total Exosome Isolation for serum or plasma (Invitrogen, MA, USA)——TEI

ExoQuick™ Exosome Precipitation Solution (System Biosciences, CA, USA) ——EXQ

RIBO™ Exosome Isolation Reagent (RIBO, Guangzhou,China) ——REI

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1种用于直接从血清/血浆中提取外泌体RNA的试剂盒（无需预先分离外泌体）：

exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)——EXR

研究结果

人血清/血浆外泌体产量和纯度比较

共计5名志愿者参与试验，从其配对的血浆/血清中分离外泌体后用NanoSight NS 300系统（NanoSight）检测外泌体浓度和大小。TEI、EXQ和REI三种试剂盒分离得到囊泡数量存在显著差异，REI能够富集到最多的囊泡。这三种Kit分离的大部分囊泡直径约为30-150nm，与先前报道的外泌体大小分布一致。血清中能够分离更多囊泡，且相比于配对血浆样品，血清中直径大于200nm的囊泡所占比例更高。

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接下来作者比较了三种方法富集典型的外泌体蛋白和去除高丰度白蛋白的效率，采用Western Blot方法鉴定2种经典外泌体蛋白质标志物CD63和TSG101。EXQ富集的外泌体中CD63和TSG101含量最高，TEI分离的外泌体中TSG101含量最低。血清分离的外泌体中两种蛋白质标记物的量高于血浆分离的外泌体。所有样本中都有不同程度的白蛋白污染，TEI分离的外泌体中白蛋白污染程度最低，而REI则最高。同样，血清分离的外泌体中白蛋白污染程度高于血浆。

血清/血浆外泌体miRNA高通量测序分析

随后，对外泌体miRNA的回收效率进行了评估。作者使用4种试剂盒（包括TEI、EXQ、REI和EXR）从20个独立的血清或血浆样品混样提取外泌体RNA，并比较不同方法提取的外泌体RNA特征。所有提取的RNA质量都很好，其小RNA峰在20-25个核苷酸，除了用EXR从血浆中分离出的外泌体RNA，其总量不足以进行Illumina测序。小RNA测序共计检测到797个miRNA（> 10个拷贝），其中EXR-血清、EXQ-血清、EXQ-血浆、TEI-血清、TEI-血浆、REI-血清和REI-血浆中分别检测到了385、411、296、448、316、457和268个miRNA，且不同方法的miRNA表达丰度略有差异。相关性分析表明，这些方法得到miRNA表达之间具有强相关性（R²>0.93，P <0.001）。通过比较血清和血浆外泌体miRNA表达谱发现，血清外泌体miRNA具有更高的表达丰度。

RT-qPCR试验分析外泌体miRNA

作者进一步分析了4种方法提取的外泌体RNA中特定miRNA的潜在差异。作者从miRNA测序检测到的miRNA中，选择了表达丰度由低到高的4个小RNA：miR-127-3p、miR-25、miR-16和let-7d，并使用RT-qPCR在20个独立的血清/血浆样品中检测这些分子。4种Kit在检测miRNAs的Cq值方面具有不同表现：EXR和EXQ在检测let-7d、miR-16和miR-127-3p方面均表现出良好的性能，但使用EXQ比使用EXR提取的外泌体RNA中miR-25浓度显著更高（P <0.001）；与EXQ或EXR相比，REI得到外泌体RNA中含有较高浓度的miR-127-3p、miR-25和血清let-7d，但只有较低丰度的miR-16和血浆let-7d（与EXR相比，P <0.001）；此外，4种Kit之间miRNA Cq值的相关性分析显示，血清和血浆样品中EXQ和EXR之间的R²系数最高；另外，与其他2种方法相比，REI与TEI的相关性更好。

当比较血清和配对血浆样本间miRNA的Cq值时，每种试剂盒从血清中提取的外泌体miRNA显著高于血浆，与高通量测序结果一致。EXQ和EXR方法的血清和血浆miRNA表达之间相关性R²值（R²> 0.6）比其他两种方法更有意义。

这些结果表明，尽管在4种分离方法之间获得了外泌体miRNA表达谱的强相关性，但是对于特定miRNA（包括let-7d、miR-16、miR-25和miR-127-3p）的RT-qPCR检测水平受到外泌体分离试剂盒的影响。在这些试剂盒中，EXQ在所有4个miRNA分子的检测中表现最好。

重复性比较

为了评估4种Kit分离的外泌体miRNA的可重复性，作者将从20名志愿者的血清或配对血浆混样，分别等分成20份各150μL的样本。对于上述特定的miRNA的检测，所有方法具有可接受的CV（<10％），对于特定miRNA的检测，其CV值分别为0.88-3.82%（EXR）、1.19-3.77%（TEI）、0-2.70%（EXQ）和1.23-9.11％（REI）。其中，REI方法的可重复性相对最低，这可能是由于REI方法分离的外泌体具有相对较高的白蛋白污染。

总结与讨论

综上，各个Kit在分离的外泌体含量和外泌体miRNA丰度以及可重复性方面存在各自特征，比如尽管REI能够分离得到最多的外泌体，但白蛋白杂质较多；而SBI的EXQ能够分离到相对较多的外泌体，且白蛋白污染相对较少；TEI则分离得到的外泌体最少，但纯度相对最高；外泌体miRNA测序和定量分析时，EXQ在所有4个miRNA分子的检测中表现最好。

循环外泌体miRNA生物标志物研究选择血浆还是血清，仍然是一个悬而未决的问题。一些研究表明采集血液后，血小板在凝血形成期间可以释放许多胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs），而血小板衍生的EVs可能占血清EVs的50％以上，这比血浆中的囊泡高出十倍以上。这一发现表明血浆可能是血液中EVs的生理介质。

本研究发现：血清在每个研究的Kit中均产生比配对血浆更大量的外泌体；另外，从血清中分离出的囊泡显示出更多的白蛋白杂质；与相应的血浆相比，血清中还发现更高的miRNA水平。尽管，在小RNA测序或RT-qPCR测定试验中，血清和血浆之间的外泌体miRNA的Cq值有显著相关性。

本研究中血清和血浆的比较可以为选择血清或血浆分析外泌体miRNA作为有效的非侵入性生物标志物提供参考。

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参考文献

DING, Meng, et al. Comparison of commercial exosome isolation kits for circulating exosomal microRNA profiling. Analytical and bioanalytical chemistry, 2018, 410.16: 3805-3814.

延伸阅读