ATAC-Seq、RNA-Seq和WGS多组学联合揭示PRDM10重组肿瘤发病机制

导读

未分化多形性肉瘤（UPS）是一种高度侵袭性的软组织肿瘤。UPS的一种特征是CITED2-PRDM10或 MED12-PRDM10的基因融合。初步数据表明，这些所谓的PRDM10重组肿瘤（PRT）在临床上相比于典型的高级别的UPS症状更加不显著，因此对其准确识别非常重要。本文作者使用基因组阵列、WGS和RNA-Seq评估了PRT中伴随的突变图谱和基因表达图谱。通过对成纤维细胞中CITED2-PRDM10融合基因的表达进行RNA-Seq和ATAC-Seq进一步研究了融合蛋白的功能。CADM3基因在PRT和细胞系中存在差异上调，并使用免疫组化（IHC）在蛋白水平评估其表达。基因组分析发现除了引起基因融合的结构变异之外还有少量低频突变，这表明PRDM10融合关键的驱动突变。肿瘤RNA-Seq显示了不同的基因表达谱，将PRT与高级别UPS和其他软组织肿瘤区分。CAMD3是在PRT和CITED2-PRDM10表达的成纤维细胞中始终高表达，表明它是PRDM10转录因子的直接靶标。这一结论与ATAC-Seq结果一致，显示PRDM10结合位点富集，提示氨基末端的融合伙伴有助于使DNA更容易与PRDM10结合。

中文名称：PRDM10融合的未分化多形性肉瘤具有独特的基因表达谱

英文名称：Undifferentiated pleomorphic sarcomas with PRDM10 fusions have a distinct gene expression profile

期刊：Journal of Pathology

影响因子：5.979

时间：2019

作者：Jakob Hofvander

单位：瑞典隆德大学

材料与方法

研究材料：8例PRT患者肿瘤组织和CITED2-PRDM10成纤维细胞

实验方法：RNA-Seq、WGS、ATAC-Seq和免疫组化

研究结果

1、肿瘤中基因融合状态

5个PRT含有MED12–PRDM10融合和3个CITED2–PRDM10 融合。RNA-Seq结果显示MED12和PRDM10的融合略有差异，分别是外显子42或43与外显子13或14并列，而CITED2的融合点总是在外显子2中。

2、PRT基因表达谱

6个PRT的基因表达谱与其他45个软组织肿瘤基因表达谱进行了比较，包括17个高级别的UPS和7个MFS。通过对1737个变量进行无监督层聚类，PRT形成了一个特有的表达模式；此外，三个CITED2-PRDM10的PRT和三个MED12-PRDM10的PRT形成了单独的子集（图1A）。404个编码基因在PRT与其他肿瘤类型中显著差异表达。

PRDM10不是显著差异表达的基因，但是其表达水平CITED2-PRDM10中高于MED12-PRDM10中。两个差异表达最明显的基因是表面受体跨膜丝氨酸蛋白酶4（TMPRSS4）和细胞粘附分子3（CADM3）（图1B和C）。相当于29个对照样品，TMPRSS4和CADM3在4个PRT FFPE样本过表达。

TCGA-SARC队列中未发现涉及PRDM10融合转录本的UPS和MFS样品。UPS、MFS和PRT样品PCA分析显示，PRT与UPS和MFS呈现分离，UPS和MFS混杂在一起。与UPS和MFS样品相比，PRT中CADM3和TMPRSS4始终高表达，突出了它们作为诊断标记的潜力。IHC结果显示所有的三个PRT中CADM3强烈表达，而其他14例软组织肿瘤均为阴性。

 图1 PRT与五种形态相似肿瘤类型的基因表达分析

图2 CADM3 IHC分析

3、细胞系中基因表达谱和ATAC-Seq结果

CITED2-PRDM10（C-P）融合表达的细胞（n=3）和EV表达的细胞（n=4）中基因表达，发生巨大变化，16%的编码基因存在差异表达。在PRT中发现的242个上调基因中有77个与表达融合细胞系中重叠，包括CADM3和TMPRSS4。免疫组化证实了CADM3表达增加，在CITED2-PRDM10融合的Bj5ta细胞中发现了强表达，而EV的Bj5ta细胞则表达阴性（图2）。

融合基因的表达也导致了染色质可及性的改变。ATAC-Seq显示C-P和EV有41% peaks开放差异，PRDM10作为转录因子富集的motif，表明CITED2-PRDM10融合仍然与PRDM10结合位点相互作用，并认为其在观察到的染色质可及性变化中发挥重要作用。Top共富集的GO term表明融合影响发育和分化的几个过程。

在总peaks（n=145,364）中，有670个被报道在融合表达细胞启动子区域差异开放，122个带有PRDM10 motif。启动子区域开放的基因包括CADM3（图3），但TMPRSS4不是，内含子7上有一个差异开放peak。C-P细胞并没有表达全长的TMPRSS4转录本，而是从8号外显子开始，就在识别peak的下游（图3），并且在PRT中也表达相同的转录本。

与EV相比，WT和ZFO的差异表达基因少于C-P，并且这些基因中约有一半与C-P比EV中发现的基因重叠（图4）。ATAC-Seq中也有类似的结果，与EV相比，WT和ZFO对染色质可及性变化小于C-P。在WT和ZFO不同开放启动子区域中，分别有42%和59%与C-P重叠（图3）。

基因表达谱PCA分析显示C-P和EV形成不同的clusters，而WT和ZFO形成混合cluster（图4）。过表达WT和ZFO对细胞系的影响似乎类似，虽然它们会导致整体基因表达的改变，但其影响要小于C-P。启动子区域peaks PCA分析显示尽管WT和ZFO形成了单独的cluster，启动子区域的染色质可及性变化最大的是C-P和EV（图3）。RNA-Seq和ATAC-Seq均显示CITED2-PRDM10融合基因过表达导致基因表达和染色质可及性变化大于WT和ZFO。

图3 CITED2–PRDM10 (C-P)、 WT、 truncated (ZFO)或 EV 质粒的人成纤维细胞系启动子区域ATAC-Seq

图4 CITED2–PRDM10 (C-P)、 WT、 truncated (ZFO)或 EV 质粒的人成纤维细胞系基因表达分析

4、基因功能

5例病例SNP-array信息中，三个无失衡，一个有del(11)(q14q22)、del(12)(p11p13)和-14，一个有7个16号染色体三倍体。在两个PRT个体WGS结果中SNVs数量低：样本4a中有633个SNVs和171个indels，样本5a中有1030个SNVs和349个indels。这两种肿瘤中都没有受影响的基因，也没有与高等级UPS中常见的突变基因重叠。两个病例中分别有16次和95次结构重排，确定了与MED12、CITED2和PRDM10中预期断点相关的易位。两种融合的每个基因都有多个断裂，这表明在融合过程中有超过两个DNA双链断裂。

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文：唐林

排版：市场部