Hepatology：微生物多样性+单细胞多组学揭示B细胞在非酒精性脂肪肝炎中的调控机制

英文题目：Microbiota-Driven Activation of Intrahepatic B Cells Aggravates Nonalcoholic Steatohepatitis through Innate and Adaptive Signaling

发表杂志：Hepatology

影响因子：14.679

原文链接：https://aasldpubs.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/hep.31755 

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)正迅速成为肝衰竭的主要原因和肝移植的适应症。肝炎症是NASH的一个关键特征，但参与这一过程的免疫途径尚不清楚。B淋巴细胞是适应性免疫系统的细胞，是免疫应答的关键调节因子。然而，B细胞在NASH发病中的作用以及导致其在肝脏中激活的潜在机制尚不清楚。

明尼苏达大学Fanta Barrow研究团队于2021年2月20日在权威肝脏病学杂志Hepatology发表了非酒精性脂肪性肝炎最新研究进展。该文章利用了单细胞测序、微生物多样性等技术手段阐明了微生物驱动激活的肝内B细胞通过先天和适应性信号通路加重非酒精性脂肪性肝炎，为肝衰竭相关疾病提供了理论依据和新见解。

研究方法

在本研究中，作者发现NASH肝脏积累B细胞，增加促炎细胞因子分泌和抗原呈递能力。NASH小鼠肝内B细胞的单细胞和整体RNA测序揭示了反映其促炎功能的转录图景。因此，B细胞缺乏改善NASH进展和从NASH肝脏过继转移B细胞是该病的原理。从机制上讲，NASH过程中的B细胞激活包括通过先天适配器髓系分化初级反应蛋白88 (MYD88)信号，因为B细胞特异性删除MYD88可减少肝脏T细胞介导的炎症和纤维化，但不能减少脂肪变性。此外，肝内B细胞的激活暗示B细胞受体信号，描绘抗原识别的先天和适应性机制之间的协同作用。此外，将人类NAFLD肠道菌群移植到受体小鼠，通过增加肝内B细胞的积累和激活，促进NASH的进展，提示肠道微生物因素驱动NASH期间B细胞的致病功能。

研究结论

本文的研究结果表明，肠道微生物群驱动的肝内B细胞激活可通过先天和适应性免疫机制导致NASH进展过程中的肝脏炎症和纤维化。

实验材料

• 材料：6周的 C57BL/6J (WT)、μMT、Cd19 cre、Myd88 fl 、Nur77 GFP 小鼠；正常食物(NCD)小鼠组，或高脂肪高碳水化合物食物(HFHC)小鼠； 1个正常人和3个肥胖患者（NAFLD）。

• 方法：10x 单细胞转录组测序；微生物多样性检测；RNA-seq

研究结果

1. 促炎B细胞在NASH肝脏中富集

为了确定肝内B细胞在NASH进展中的作用，文中给WT小鼠喂食高脂高脂饮食（HFHC），诱导NASH的人类相关特征长达20周。利用通过无监督聚类和高维单细胞分析对喂养小鼠分选的免疫细胞进行亚群分类检测。研究表明，无论饮食如何，肝脏中CD19 ⁺ B220 ⁺ B细胞占所有CD45 ⁺免疫细胞的20~30%(Fig. 1A)。与非传染性疾病对照组相比，HFHC喂养的小鼠肝脏早在5周时单核细胞和巨噬细胞数量增加，10周时B细胞、自然杀伤细胞(NK)和树突状细胞(DC)数量增加，15周时T细胞数量增加(Fig. 1B)。

图1. 小鼠肝脏免疫细胞鉴定

无论饮食如何，肝内B细胞以B2细胞为主，只检测到少量B1b细胞。与NCD相比，HFHC喂养的小鼠B2比例增加，B1b细胞比例降低。如前以往研究，肝内B2细胞主要为IgM ⁺ IgD ⁺，类似于脾B2细胞。为了评估B细胞细胞因子的产生，测定了在用phorbol 12-myristate 13- acetate (PMA)或几种TLR激动剂进行体外刺激后，B细胞内肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)和白细胞介素(interleukin, IL)-6的表达。HFHC喂养导致在PMA和LPS刺激后表达TNF和IL-6的B细胞数量增加。巨噬细胞释放最多的TNF和IL-6，其次是中性粒细胞和B细胞。与非传染性疾病对照相比，所有类型的细胞在HFHC小鼠中释放的IL-6和TNF都增加了(Fig. 1E)。来自HFHC小鼠的B细胞也显示细胞表面主要组织相容性复合体(MHC) I类和II类和CD86上调，提示激活和抗原提呈能力增强(Fig. 1F)。这些结果表明，活化的B细胞释放促炎细胞因子和抗原的能力增强，在NASH期间聚集在肝脏中。

图2. 小鼠肝脏B细胞在NASH期间聚集在肝脏中

2. 单细胞测序揭示NASH期间肝内B细胞促炎基因图谱

 为了更好地理解NASH如何改变B细胞的转录组谱，文中对来自NCD和HFHC肝脏的免疫细胞进行了单细胞RNA测序。单细胞降维聚类显示有24个CD45 +免疫细胞聚类，通过免疫细胞marker基因集鉴定了不同簇的B细胞，单核细胞，巨噬细胞，自然杀伤T (NKT)细胞，中性粒细胞，T细胞，NK细胞，浆细胞样树突状细胞，先天淋巴细胞和传统树突状细胞。HFHC喂养的肝脏显示百分比的增加集群2、3和4(单核细胞)、5 (monocyte-derived巨噬细胞),19(中性粒细胞),9 (CD8 T细胞)和17 (DCs),以及减少的百分比集群11和13 (B细胞),7(枯否氏细胞),0 (NKT细胞),14(血浆DCs)(Fig. 2A).。作者重点研究了B细胞簇的基因表达谱，并确定了最大的B细胞亚群(簇1)由表达Sell、Fcer2a、H2-aa和Ighd的成熟B细胞组成(Fig. 2B)。结合B细胞簇后，在NCD和HFHC肝脏中检测到63个差异表达基因(DEGs)(表S3)，这些基因在HFHC B细胞中显示炎性基因Il1b、S100a8、Cxcl2、Cxcr4和H2-aa的表达增加。

图3. NCD和HFHC肝脏的免疫细胞图谱

这些发现表明了NASH肝内免疫细胞形态的异质性及其向炎症表型的转变。为了提高在NCD和HFHC条件下检测B细胞DEGs的能力，还对NCD或HFHC小鼠肝脏中纯化的B细胞进行了大规模RNA测序(RNA-seq)分析。多维尺度显示，来自NCD和HFHC小鼠的B细胞之间存在明显的分离，HFHC中生物复制之间存在高度一致性，而NCD组中存在一定的多样性。基因表达分析显示，HFHC B细胞中有1179个DEGs，其中570个DEGs上调，609个DEGs下调（Fig. 2D）。与单细胞分析一致，HFHC B细胞中有几个促炎基因上调（Fig. 2E）。GO和kEGG富集分析也表明差异表达基因主要富集在相关炎症通路（Fig. 2F）。这些发现与肝内B细胞功能分析是一致，B细胞活性激活与HFHC喂养小鼠炎症表型增加相关。

图4. NCD和HFHC肝脏B细胞差异表达分析

3. B细胞缺乏可改善NASH期间的炎症和纤维形成

为了确定B细胞是否在NASH发病机制中起直接作用，我们评估了15周HFHC喂养的B细胞缺陷μMT小鼠NASH进展情况。与野生型对照相比，体重没有变化，但是葡萄糖(GTT)、胰岛素(ITT)和丙酮酸(PTT)耐受性试验均有所改善(Fig. 3A)。肝重和肝甘油三酯也无差异，这表明代谢改善与脂肪变性的变化无关（Fig. 3B）。HE染色表明μMT较低的炎症成分，而且μMT小鼠肝脏中促炎基因的表达显著减少（Fig. 3C）。

图5. B细胞缺陷μMT小鼠促炎基因的表达

由于B细胞可以通过抗原呈递激活T细胞，我们检测了naïve、中央记忆(CM)和效应记忆(EM) T细胞的频率以及IFN和TNF在HFHC μMT小鼠中的表达。与WT对照相比，HFHC μMT小鼠肝脏EM CD4和CD8 T细胞百分比降低。IFNγ ⁺ CD4 T细胞，TNFα ⁺ CD4和CD8 T细胞无差异（Fig. 3E）。而且HFHC μMT小鼠的纤维化程度明显降低，纤维生成基因表达降低(图3F)，血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平降低，证实B细胞促进NASH期间肝损伤。

图6. B细胞缺陷μMT小鼠T细胞比例变化

4.B细胞在NASH进程中调控机制

（1）肝内B细胞刺激效应记忆和T辅助因子1 (Th1)

在确定了B细胞的遗传缺陷会降低T细胞的激活后，作者假设抗体介导的B细胞缺失可以逆转NASH期间EM T细胞的生成。单剂量的单克隆抗CD20抗体(CD20 mAb)可使肝脏、血液、脾脏和脂肪组织中的大部分B细胞至少减少3周。在第6周、9周和12周的饮食治疗中给HFHC喂养的小鼠注射三剂CD20单抗或同型对照，并在第15周测定其效果。结果表明CD20单抗不影响体重和肝重，缺乏肝内B细胞不影响其他免疫细胞。与μMT小鼠的遗传缺陷类似，CD20 介导的B细胞耗尽降低了肝脏中EM CD4和EM CD8 T细胞的频率(图4C)，证实了B细胞在NASH期间促进T细胞激活的作用。

图7. B细胞在NASH期间促进T细胞激活

（2）细胞内固有的MYD88介导NASH中B细胞的促炎功能

RNA-seq分析确定MyD88是HFHC小鼠肝B细胞促炎基因的上游上游调控因子。为了研究B细胞内在的MYD88信号是否影响NASH进展，我们使用了B细胞特异性缺失MYD88 (B- MYD)的小鼠，并研究了它们对15周高脂高脂饲料的反应。HFHC喂养的B-MYD小鼠肝脏重量和甘油三酯含量相似，HE染色和相应的NAS评分显示脂肪变性无差异，但B-MYD小鼠的NAS总评分较低，因为炎症NAS成分较低。来自HFHC喂养 B-MYD小鼠的肝内B细胞显示细胞表面MHC-I和MHC-II的表达降低。同样，HFHC B-MYD小鼠的EM CD4和CD8 T细胞比例较低，提示MYD88是NASH期间B细胞促进肝脏炎症、纤维化和损伤所必需的。

 图8. MYD88介导NASH中B细胞的促炎

（3）通过BCR刺激激活肝内B细胞促进NASH

接下来，作者确定NASH期间肝内B细胞的激活是否涉及直接BCR刺激，使用一种报告小鼠，在Nur77基因的控制下，BCR信号诱导绿色荧光蛋白(GFP)的表达。用NCD或HFHC喂养Nur77-GFP小鼠15周，用流式细胞术检测肝脏、结肠和脾脏中表达GFP和CD69的B细胞比例。HFHC Nur77-GFP小鼠肝内GFP ⁺ CD69^- B细胞的频率和数量显著增加，这表明NASH期间的激活涉及肝脏中BCR的优先刺激。HFHC Nur77-GFP小鼠增加了GFP ⁺结肠固有层B细胞，脾脏GFP ⁺ B细胞的数量和频率无明显差异。这些数据表明，B细胞和T细胞在NASH期间感知到更强的抗原受体信号。

图9. 肝内、肠内和脾脏内B细胞GFP信号表达

（4）肠道来源的微生物因子促进肝内B细胞激活

为了研究NAFLD相关的生态失调导致的细菌产物是否促进肝内B细胞激活，作者构建了一个FMT模型，该模型由抗生素治疗小鼠，然后用人类供体粪便微生物进行灌胃处理。与未治疗组相比，FMT组抗生素治疗使FMT时微生物多样性明显减少（Fig. 7A），这表明本地微生物群被成功破坏了。粪便群落特征显示，在FMT时，抗生素处理的小鼠的优势门拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)减少，在FMT后第7天恢复。与供体的组成一致的是在FMT后的第一周，NAFLD菌群受体的厚壁菌门(Firmicutes)丰度至少在8周内下降，而拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)丰度增加（Fig. 7B）。最终确定来自3个NAFLD供体的微生物群的FMT对接受小鼠NASH进展的影响。与健康FMT相比，FMT 10周后，NAFLD微生物群的受者肝脏重量、甘油三酯、和HE染色的脂肪变性和总NAS评分轻度增加。接受NAFLD FMT的小鼠肝内B细胞数量增加，增加抗原呈递和共刺激分子的表达。NAFLD相关的肠道微生物群的变化足以诱导B细胞在肝脏中的积累和激活，同时将肝脏病理的各个方面从人类供体小鼠传递到受体小鼠。

图10. 肠道来源的微生物因子促进肝内B细胞激活

总结

本文通过单细胞测序技术证明了促炎B细胞在NASH肝脏中积累。B细胞缺陷小鼠被喂食nash诱导的饮食后，肝脏胰岛素敏感性、炎症和纤维化得到改善。B细胞特异性耗损髓系MYD88改善NASH进展，表明B细胞激活是由toll样受体(TLR)信号下游的典型适配器介导的。意外发现，NASH中的B细胞反应也涉及B细胞受体(BCR)信号，提示B细胞整合了先天和适应性免疫激活机制。最后，微生物多样性检测表明人类NAFLD肠道菌群的粪便菌群移植(FMT)可增加肝脏中B细胞的积累和激活。总的来说，本文说明了肝B细胞在驱动NASH进展中的关键作用。

文：驷说

排版：市场部

文献下载：

https://international.biocloud.net/zh/article/detail/33609303

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