全长单细胞RNA测序揭示人类先天淋巴细胞组织特异性转录印记和异质性

英文题目：Tissue-specific transcriptional imprinting and heterogeneity in human innate lymphoid cells revealed by full-length single-cell RNA-sequencing

发表时间：20210108

发表杂志：Cell Research

影响因子：20.507

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41422-020-00445-x

摘要

微环境对人类固有淋巴样细胞(ILC)介导的免疫的影响在很大程度上仍不清楚。在这里，本文使用全长Smart-seq2单细胞RNA测序来揭示CD127⁺ILCs在四个人体组织中的组织特异性转录图谱和异质性。相关性分析确定了扁桃体和血液ILCs迁移特性的基因模块，以及结肠和肺ILCs的组织驻留、激活和修饰代谢的特征。轨迹分析揭示了从循环和组织驻留的naive ILCs到成熟ILC亚群的潜在分化途径。在肺中，本文发现CRTH2⁺和CRTH2^-ILC2都具有肺特异性特征，这可以通过暴露循环中ILC2的警报来重述。最后，本文描述了血液中ILC1样细胞独特的TCR-V(D)J-重排模式，揭示了具有TCR-δ重排的潜在未成熟ILCs的子集。 图1-1 实验流程

先天淋巴细胞(Innate Lymphoid Cells，ILCs)是新近加入的先天免疫细胞，在清除细胞内外病原体、调节适应性免疫、组织修复和促进炎症方面发挥着重要作用。它们的主要特征是缺乏重排的抗原特异性受体，这是它们与T细胞的不同之处。然而，在其他方面，这些细胞密切反映了它们的适应性细胞的功能，是与1型、2型和17型免疫反应相关的细胞因子的重要来源。目前，ILC分为五个亚群：ILC1、ILC2、ILC3、自然杀伤(NK)细胞和淋巴组织诱导(LTI)细胞。

最近单细胞技术在转录和蛋白质水平上的发展迅速推进了本文对人类免疫系统异质性的理解。在细胞数量要求方面，单细胞RNA测序(scRNA-seq)能够对少量细胞进行转录分析。到目前为止，已经在小鼠身上进行了特定ILC亚群或特定组织的scRNA-seq。类似地，在人类中，scRNA-seq用于一个亚群(NK细胞)或一个组织(回肠和扁桃体)的转录组分析，导致对ILC组织特异性印记的了解受限。在这项研究中，本文通过全长scRNA-seq分析了人类ILC，结合了四种不同组织的数据：血液、扁桃体、肺和结肠。组织之间的比较揭示了组织特异性转录印记，并使本文有可能首次在人类中比较循环、次级淋巴器官(SLO)和粘膜组织中ILC的scRNA-seq的转录图谱。该数据以公开资源的形式进行分享，揭示了人类ILCs以前未知的功能并扩展本文目前对人类ILC生物学的理解。

实验材料

肺组织细胞分离取自接受肺叶切除术的4例肺癌患者(年龄57~76岁，女性3例，男性1例)。从3例健康献血员(年龄29~32岁，男2例，女1例)的全静脉血中分离外周血单个核细胞(PBMC)。升结肠活检取自3例肿瘤筛查患者(年龄57~71岁，男2例，女1例)，每名患者收集8份穿孔活检组织。

结果

一、scRNA-seq揭示亚群和组织特异性转录印记在单细胞水平的人类和小鼠的组织中，ILC的转录图谱揭示了ILC依赖于组织微环境的独特特征。在这里，本文对来自三个组织的人CD127⁺ILC进行了流式细胞术分选，这些组织代表两个不同的免疫细胞区段：循环(血液)和粘膜组织(肺和结肠)(3-4个样本/组织)。作为参考人群，本文纳入了先前描述的组织NK细胞表型谱中的选定NK人群。从肺中分离出主要循环的CD56dimCD16+NK细胞，从胃中分离出大量的CD56+NK细胞，从扁桃体中分离出CD56brightNKG2A+NK细胞。然后对12个细胞样本进行全长Smart-seq2 scRNA-seq，以揭示深层组织特异性转录图谱和异质性。本文之前发表的来自扁桃体的CD127+ILC和NK细胞的Smart-seq2 scRNA-seq数据集(12个代表SLO)也被囊括在分析中。所有的数据集被组合在一起进行分析，以确定组织和细胞类型之间的共同和不同的模式(图1a)。在四个组织中的总共2956个细胞进行了分析(图1b)。使用UMAP可视化显示，所有ILC亚群以及NK细胞根据起源组织和FACS分类的细胞进行聚类(图1b，c)。基于无偏聚类将细胞细分为20个簇，根据起源组织和FACS表型将细胞分开(图1d)。本文观察到蛋白质FACS表型与scRNA-seq中确定的簇之间有90%的一致性。接下来，本文使用先前描述的人类ILC子集特异性TF和细胞表面标记物来注释细胞簇(图1e，f)。5簇(肺)、15簇(扁桃体)和19簇(结肠)，表达NKG7、Eome和GZMA/B，但缺乏IL7R，被标记为NK细胞。8簇(血液)、13簇(扁桃体)、18簇(肺)表达IKZF3，但缺少Eome和KIR2DL1/3，被注释为ILC1。17簇由扁桃体和血液CD127+ILC组成，它们表达低水平的eome，将它们注释为eome+ILC1。根据GATA3、MAF、PTGDR2和HPGDS的独特高表达，簇6(血液)、11(扁桃体)和12(肺)被注释为ILC2(图1e，f)。
图1-2 scRNA-seq揭示了亚群和组织特异性转录印记b:UMAP可视化展示所有细胞(n=2956)，根据组织来源进行颜色着色。c：所有细胞的UMAP可视化，根据FACS分类的细胞表型进行颜色着色。d: UMAP展示所有细胞的无偏聚类分析。e：UMAP展示所有注释到的簇。C_，结肠；L_，肺；B_，血；T_，扁桃体；nILC，naive ILC。f：点图展示所选和先前描述的人ILC子集特异性TFs和用于注释的细胞标记物的表达 二、ILC的迁移性和组织驻留性转录图谱为了确定组织和细胞类型共享的保守基因表达模式，本文使用了两步法，而不是简单的差异表达(DE)，DE基因列表它揭示了细胞类型和组织之间的差异，而不是相似之处。对于两步法，本文选择了20个簇(4410个基因)中每一个簇排名靠前的DE基因，然后进行了加权基因共表达网络分析(WGCNA)，以确定100个基因模块（图2a，b）。为了避免具有不同表达模式的基因进入同一组，选择了大量的模块。具有高度相关表达式的模块在图中用连接线表示(图2c)。接下来，根据模块对区分组织、细胞类型和/或细胞团的贡献进行单独评分(图2c)。对代表独特免疫生态位的四种不同组织(循环组织、淋巴组织和粘膜组织)的分析，结合无偏见的基因模块分析，使本文能够识别组织和细胞类型的保守模式(图2d)。本文鉴定了两个基因模块(41和11)，它们分别包含与原型T细胞迁移分子S1PR1和SEL的表达高度相关的转录本(图2d)。这两个模块中的基因在扁桃体和血液ILC(包括nILC)中高表达。这些模块包括糖酵解相关的转录本LDHB，粘附分子转录本ICAM3，以及几种S100蛋白的转录本(S100A4，S100A6和S100A11)(图2d)，表明它们参与了迁移。本文证实了与结肠ILC相比，血液ILC缺乏CD69，高表达的CD18和CD62L，而在结肠ILC上有低表达的CD18和CD62L，高表达的CD69，从而证实了血液与结肠ILC截然相反的迁移性和组织驻留性特征(图2e)。扁桃体表现为混合表型，无论是机械分离还是酶分离(图2f)，表现为CD62L的低表达，CD18的中等表达，部分细胞表达CD69，这与小鼠次级淋巴组织中既有组织驻留细胞又有移行细胞的存在相一致。和CD69-扁桃体ILC相比，CD69⁺扁桃体ILC表达低水平的CD18(图2g)。同样，NKp44的表达与CD18的表达降低有关(图2g)。这些数据不仅证实了转录结果，而且还表明与结肠相比，扁桃体CD69+表达内皮粘附整合素CD18，正如血管内肝内驻留T细胞所描述的那样。综上所述，本文确定了三个基因模块，可以表征扁桃体和血液ILC(包括血液nILC)的淋巴和外周组织归巢特性。另外四个模块包含已知和潜在的激活和/或组织驻留相关蛋白的转录本，这些转录本显示了结肠、肺和扁桃体的组织限制性表达。这些基因大部分在结肠和肺ILC中高表达，包括组织中的nILC，但在一定程度上也在扁桃体ILC中高表达。重要的是，这些基因在血液ILC(包括血液nILC)中不表达。此外，据报道正在循环的肺NK^dim细胞也显示出与组织驻留相关的转录本的低表达。
图2 ILCs的迁移和组织驻留转录图谱a：用于识别基因模块和进行轨迹分析的方法概述。b：所有细胞的UMAP可视化，根据组织来源进行颜色着色。c：圆形树状图用来说明每个模块的数量和组成。d：与组织和/或包含迁移或组织驻留相关基因的细胞类型/簇高度相关的基因模块。e:与来自血液、扁桃体和结肠活检的总ILCs中CD69和CD18/CD62L(顶行)及NKp44和CD18/CD62L(底行)的共表达。f：直方图展示扁桃体ILCs中CD18、CD62L和CD69的表达。g:条形图量化e中的结果。 三、基因模块揭示ILC3的亚群和组织特异性图谱模块6指定了假定组织的共同特征，即肺和结肠中残留的ILC(图2d)。值得注意的是，这个模块中的一些基因特别局限于这两个组织中的ILC3(图3a，b)。这些包括编码HLADR、-DP和-DQ的转录本(图3b），本文先前在扁桃体中描述了这些转录本。此外，效应细胞因子GM-CSF、CSF2和BHLHE40的转录本在肺和结肠ILC3中表达，进一步表明与扁桃体ILC3相比，ILC3在结肠和肺相关的转录印记(图3b)。有趣的是，结肠ILC3既表达了编码白三烯B4(LTB4)形成酶LTA4-水解酶的LTA4H，也表达了编码LTB4受体LTB4R的转录本，表明LTB4在结肠特异性调节ILC3功能中发挥了作用。进一步强化这一假设的是，结肠ILC3的一部分表达了LTB4R表面蛋白(图3c)。综上所述，本文通过对以前未被人类ILC3表达的转录本的描述，揭示了血液和组织中nILC的转录特征，揭示了ILC3之间的组织特异性差异以及这些细胞潜在的新功能。
图 3-1 ILC3的组织特异性和亚群特异性a：UMAP可视化注释到的ILC3和NILC簇(C_，结肠；L_，肺；B_，血液；T_，扁桃体；NILC，naive的ILC)。b：与组织和ILC3高度相关的基因模块。c：LTB4R在结肠ILC3中的表达(上图)和LTB4R在结肠ILC3、扁桃体ILC3和血液nILCs中的表达(下图)。 四、轨迹分析粘膜ILC3转录状态分支接下来，本文通过进行轨迹分析，以了解在血液和组织中发现的可能的nILC与更成熟的ILC亚群之间的潜在关系，以及结肠和肺中ILC3激活状态的潜在图谱。将这些轨迹与图1d(图3d)中确定的簇重叠，不仅说明了ILC3在结肠、肺和扁桃体中的异质性，而且还推断了这些转录上不同的ILC3亚簇之间的潜在转录关系(图3e，f)。ILC3在结肠中特别不均匀，其中四个亚群可以通过Louvain聚类被鉴定识别(结肠ILC3a-d，肺ILC3a-b，扁桃体ILC3a-b)(图1d，图3e，f)。通过比较每个组织内的簇和排名靠前20个DE基因，发现结肠ILC3a(簇1)包含具有激活的和潜在的组织驻留表型的细胞，表达与免疫细胞的趋化和招募有关的多个效应分子的转录，包括CSF2、XCL1、XCL2、CXCL8、S100A4和S100A6(图3e)。Egr1、EGR2和KLF6编码与免疫细胞激活有关的TF，和BCL2A1编码抗凋亡蛋白，都在该细胞簇中有丰富的E表达。典型的ILC3细胞因子IL22和激活标记物NCR2在结肠ILC3a和ILC3b(簇0)中都有表达(图3g，h)，后者也表现出激活的表型，分别表达与谷氨酸反应和脂质代谢相关的基因(GRM7和LTA4H)。综上所述，ILC3显示出高度的转录异质性，特别是在结肠中，本文发现了一系列具有不同激活状态的ILC3状态，在轨迹分析中分为不同的分支，从具有迁移表型的细胞到对代谢适应、组织修复和免疫细胞招募至关重要的ILC3表达的效应分子。
图3-2 ILC3的组织特异性和亚群特异性d：UMAP可视化展示ILC3簇。e：对nILC和结肠ILC3的轨迹分析显示了每个结肠ILC3簇的DE基因的选择。f：NILC和肺ILC1、ILC2和ILC3的轨迹分析显示了每个肺ILC3簇中的DE基因的选择。g：UMAP可视化展示NCR2表达。h:UMAP可视化展示IL22的表达。 五、基因模块揭示ILC2的亚集和组织特异性图谱本文的基因模块方法确定了一组在ILC2中跨三个组织特异性表达的基因(图4a，b)，组成了ILC2核心转录组。这些基因包括GATA3和MAF，以及HPGD、HPGDS和MBOAT2，后三种编码蛋白与脂质代谢有关。本文确定了一个在肺中特异表达的基因模块(编号65)，但不是扁桃体或血液中的ILC2(图4b)。主要效应分子IL13的表达表明肺ILC2高度激活。事实上，肺ILC2显示IL1RL1和IL17RB的高表达，它们分别编码ILC2激活的警报因子IL-33和IL-25的受体。潜在激活受体的其他转录本包括SLAM家族受体SLAMF1、TNFRSF9、脂肪酸受体FFAR3和PPARG，后者被证明能激活小鼠的ILC2。
图4 ILC2的组织特异性和亚群特异性特征a：UMAP可视化显示注释到的ILC2簇(L_，肺；B_，血；T_，扁桃体)。b：与ILC2或组织高度相关的基因模块。 事实上，血液ILC2在转录和蛋白质水平上都显示出与再循环和迁移相关的表型。因此，本文假设血液ILC2暴露在炎症性的2型偏离环境中可以诱导肺ILC2表型。事实上，警报的暴露增加了IL-1RL1和IL-17RB表面蛋白在血液来源的ILC2(图5a)上的表达，表现为肺ILC2。同时，CRTH2的表达被下调，这可以通过警报介导的CRTH2配体PGD2的内源性产生来促进。这一发现增加了在肺中报警激活的ILC2可能不表达CRTH2的可能性。对CRTH2-vs CRTH2+细胞转录谱的评估表明，ILC2相关基因存在于CRTH2-ILC2中，而且与肺ILC1和ILC3相比，ILC2相关基因的水平和频率更高(图5b，c)。综上所述，本文揭示了ILC2在血液、扁桃体和肺中的组织特异性转录差异，特别是与迁移、组织驻留和组织微环境感知有关。
图5将血ILC2暴露于警报器可重现肺ILC2的表型。a：IL-1RL1、IL-17RB和CRTH2蛋白在血ILC2表面的表达，b：UMAP显示肺内注释到的ILC簇。c：小提琴曲线图展示注释为ILC2细胞的差异表达基因。 六、基因模块揭示ILC1样细胞的亚群和组织特异性图谱模块32包含由假定的ILC1和EOMES⁺ILC1在血液和扁桃体中唯一表达的转录本(图6a，b)。与之前的报道一致，这个基因模块由T细胞相关基因组成，包括CD3D，CD3E，CD3G，CD4，CD5，CD6和CD27。扁桃体ILC1中转录本LEF1也在血液中表达。值得注意的是，这个模块中的转录本在少数肺ILC1中表达，这表明血液和扁桃体ILC1具有比肺ILC1更明显的T细胞特征(图6b)。此外，两个另外的转录模块(图6b)显示了NK细胞以及血液和扁桃体中的ILC1和EOMES⁺ILC1中的转录本，而肺中的ILC1的表达程度较低，这表明血液和扁桃体中的ILC1，特别是EOMES⁺ILC1，与NK细胞的关系比肺中的ILC1更相关。
图6 ILC1的组织和亚群特异性图谱。a：注释到的ILC1和NK细胞簇的UMAP可视化。b：与ILC1、NK细胞高度相关的基因模块。 七、血液中ILC1样细胞广泛的预测TCR V(D)J-重组由于血液和扁桃体中假定的ILC1和EBES⁺ILC1表现出T细胞的特征，为了了解ILC1的T细胞特性，本文用MiXCR分析了TCR V(D)J重排，与预期的那样，T细胞群体主要由具有重排的TCR-α和-β链的细胞组成，ILC2和nILC在TCR链上显示了最小的V(D)J重排(图7a)。这与推测的血液ILC1和EOMES⁺ILC1形成鲜明对比，在这两种情况下，大多数细胞都经历了TCR重排，尽管缺乏TCRα/β，γ/δ或CD3的表达。UMAP聚类分析显示，带有α-和/或β-TCR重排链的血液ILC1与CD4+T细胞聚集在一起(AB_T_ILC1)(图7b-d)。DE分析表明，虽然大多数ILC1表达α-和/或β-TCR恒定区的转录本(TrA-C和Trb-C)，但在α-和/或β-TCR重排的ILC1中，α和/或β-TCR基因的可变片段(TrA-V和Trb-V)的表达更为明显(图7e)。DE分析显示，具有预测重排的α/β链中的EOMES⁺ILC1显示α-和/或β-TCR恒定区和可变区以及CD8A的高表达(图7e）。因此，EBES⁺ILC1在转录水平上与Th1和细胞毒T细胞密切相关。最后，本文评估了ILC与T细胞的克隆型。正如从健康捐献者血液中预期的那样，大多数细胞代表独特的克隆型(图7f)。在具有α/β重排的ILC1和EOMES+ILC1中，有6个克隆由两个或多个细胞代表。其中两个克隆与T细胞共享。综上所述，与ILC2和nILCs相比，大多数血液ILC1和EOMES⁺ILC1在表达谱、TCR重排和克隆型方面分别与CD4⁺或CD8⁺的TCRα/β⁺T细胞极为相似。相反，具有优先δ-TcR重排的血液ILC1构成了有别于T细胞的亚群。当将在公共可获得的scRNA-seq数据集中的ILC与血液CD3⁺T细胞和CD56⁺NK细胞的转录图谱进行比较时，本文的结论进一步得到了加强，显示具有优先δ-TCR重排的血液ILC1与任何T细胞亚群之间的最小相似性。 
图7外周血白细胞和T细胞V(D)J T细胞受体基因重排。a: TRA、TRB、TRD和/或TRG基因在注释到的血ILC簇和CD4+T细胞(T)中的V(D)J重排。b：血液ILC和CD4+T细胞的UMAP可视化。c： UMAP可视化显示b中的每个子集。d：根据细胞组成和预测的TCRV(D)J-重排模式对簇进行注释。e：小提琴曲线图展示在AB_T_ILC1簇(top)、GD_ILC1(middle)和EOMES⁺ILC1(bottom)中的DE基因。f:d中不同簇中所有ILC1(top)和CD4+T细胞(bottom)每个重排TCR链具有不同克隆频率的细胞数。

总结

综上所述，本文对人类血液中ILC和CD4+T细胞的比较揭示了可能的ILC1簇，它们显示了TCRT-α/β重排和与T细胞的克隆性重叠。后者可能是表面TCR下调的T细胞污染物，而其余的可能是“失效的T细胞”，具有非生产性的TCR重排。本文还鉴定了具有TcR-δ重排的ILC，这使人联想到未成熟的ILC，而不是分化的Tbet+ILC1。本文的发现为更广泛、更精细地研究T细胞和ILC/NK细胞亚群在先天和适应性环境中的重排以及包括发育在内的这种意外的TCR重排机制提供了重要的第一步。总之，本文使用scRNA-seq鉴定了过多的ILC亚群，范围从循环和组织驻留的nILC到成熟的、活化的和组织驻留的ILC亚群，它们在四个组织中的代谢发生了变化。深入的分析揭示了肺特异性CRTH2−ILC2的存在，挑战了本文对ILC2介导的疾病的理解。此外，TCRV(D)J重排研究证实了广泛预测的TCRILC重排，以及在外周血液中通常被称为ILC1的ILC中假定的一个独特的未成熟ILC亚群。本文的发现描绘了未来研究的路线图，旨在了解组织特异性ILC介导的免疫病理学。
文：Tanbn&Anna排版：市场部

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