肝细胞癌是世界范围内死亡率排名第三的癌症，其中中国的肝癌发病率居世界之首。HBV（乙肝病毒）的慢性感染是中国肝细胞癌发生的主要原因，其感染导致肿瘤微环境常伴随慢性炎症。免疫逃逸被认为是癌症发展的标志之一，目前研究表明，肿瘤存在多种免疫逃逸机制。日前，中国学者指出研究肿瘤微环境中不同免疫细胞状态的重要性，而不同类型的单细胞测序技术则是研究不同类型免疫细胞状态和动态的有力手段。
转录组分析可以研究人体组织的基因表达，它是一个有价值的工具，以表征肝功能，基因表达变化的肝脏疾病，识别预后标记或签名，并促进发现新的治疗靶点。与全组织RNA测序分析相比，单细胞RNA测序(scRNA-seq)和空间转录组学可以在单细胞或空间水平上研究转录活性。ScRNA-seq为发现正常和病变肝脏中先前未知的细胞类型和亚型，研究罕见细胞如肝祖细胞以及非实质细胞在慢性肝病和癌症中的功能作用铺平了道路。通过将空间信息添加到scRNA-seq数据，空间转录组学转变对组织功能和细胞间相互作用原生环境的理解。这些方法最近已被应用于肝脏研究肝细胞和非实质细胞的再生、组织和分工，并描绘慢性肝病和癌症的单细胞图景。这里我们回顾scRNA-seq和空间转录组学方法背后的原理和技术，突出这些方法已经取得的最新发现和新见解肝脏生理学和疾病生物学。
scRNA-seq工作流程的主要步骤和最常用技术的比较
单细胞RNA测序分析研究肝脏病理生理
英文题目：Single cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma
（1）细胞系：流式分选HuH1/HuH7肝细胞群
（2）分选肝肿瘤细胞P1
实验方法：免疫荧光染色、流式分选、smart-seq、scRNA-seq（10x）肝细胞癌(HCC)的肿瘤内分子异质性部分归因于肝癌干细胞(CSCs)的存在。由不同细胞表面标记物定义的不同CSC群体可能包含不同的致癌驱动因素，这给定义分子靶向治疗带来了挑战。在单细胞水平结合了肝癌细胞的转录组学和功能分析来评估CSC的异质性程度。本文提供的证据表明，肝CSCs在单细胞水平上具有表型、功能和转录异质性。我们发现不同的CSC亚群包含不同的分子特征。有趣的是，不同CSC亚群中的不同基因与肝癌预后独立相关，这表明不同的肝脏CSC转录组影响肿瘤内异质性和肿瘤进展。本文为之前未被重视的CSC亚群的多样性提供了独特的视角，其分子异质性进一步强调了它们在肿瘤异质性、预后和肝脏CSC治疗中的作用。
原文下载链接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/29315726基于10x肝实质细胞转录图谱
英文题目：Landscape and Dynamics of Single Immune Cells in Hepatocellular Carcinoma 16例肝癌患者，13名男性+3名女性，并从这16例肝癌患者肿瘤和4个免疫相关部位(邻近肝、肝LNs、血液和腹水)中分离的CD45+细胞进行单细胞转录组测序。实验方法：scRNA-seq（10x）、smart-seq2、流式分选
癌旁组织和外周血是肿瘤相关研究中常用的对照组织，而其他相关的免疫器官或病理组织则较少受到关注。例如，腹水是肝癌患者常见的病理现象，其产生与肝癌预后不良有关，然而腹水中的免疫细胞组成及其与肝癌的联系尚不清楚。因此，本研究收集肝癌病人的癌组织、癌旁组织、淋巴结、外周血和腹水五种组织的CD45+免疫细胞进行实验，并分析肝癌免疫微环境中的细胞类型、表达特征，以及不同组织之间细胞的动态变化与联系。LAMP3 +树突状细胞(DCs)似乎是传统树突状细胞的成熟形式，具有从肿瘤转移到LNs的潜力。LAMP3 +树突状细胞还表达多种免疫相关配体，并显示出调节多种淋巴细胞亚型的潜力。在表现出不同转录状态的肿瘤巨噬细胞中，肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)与不良预后相关，建立了SLC40A1和GPNMB在这些细胞中的炎症作用。此外，腹水中的髓细胞和淋巴细胞主要分别与肿瘤和血液来源有关。本研究揭示的多种CD45 +细胞类型的动态特性为肝癌的免疫景观增加了新的维度。原文下载链接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/31675496肝癌中CD45 +免疫细胞的景观
三、单细胞和空间转录组-肝脏生理和病理细胞互作和新的状态（综述）
英文题目：Single-cell genomics and spatial transcriptomics: Discovery of novel cell states and cellular interactions in liver physiology and disease biologyscRNA-seq最早的应用之一是研究小鼠和人类的肝脏分区。使用scRNA-seq研究肝脏生理学的一个主要挑战是单个细胞RNA数据与空间信息的整合。为了克服这一障碍，已经开发了特定的测序策略和生物信息学分析方法，使人们对肝脏分区有了新的认识。在相关研究中，研究人员通过结合scRNA-seq和单分子RNA荧光原位杂交（smRNA-FISH）来进行空间分辨率的RNA测序，研究了小鼠肝脏分区。可以从scRNA-seq数据推断空间信息，以及原位空间转录组学鉴定肝脏中肝细胞和肝窦内皮细胞（LSECs）的分区。scRNA-seq鉴定肝脏发育和再生过程中的祖细胞，描述慢性肝病和肝硬化中非实质细胞的表型，阐明了癌上皮细胞和TME之间的相互作用，揭示肝癌内肿瘤微环境和异质性。原文下载链接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/32534107scRNA-seq了解肝细胞癌的肿瘤微环境
四、单细胞揭示肝实质细胞和非实质细胞谱系的早期出现
英文题目：Single-cell transcriptomics reveals early emergence of liver parenchymal and non-parenchymal cell lineages
15个样本，从胚胎（E）7.5（指定内胚层祖细胞）到E10.5肝（当肝实质和非实质细胞谱系出现时）；取小鼠胚胎4个时期，3个E7.5（内胚层）、8个E8.75（内胚层肠管道）、2个E9.5（肝内胚层）、2个E10.5（肝内胚层）实验方法：scRNA-seq（10x）、流式分选、免疫荧光
肝脏是一个复杂的多功能器官，由来自内胚层和中胚层的多种细胞组成(Gordillo et al.， 2015)。目前尚不清楚这些细胞类型是如何组织形成其功能所必需的高度优雅的实质细胞和非实质细胞类型的多样性，这些细胞如何从它们的内胚层和中胚层祖细胞起源，以及这些谱系如何在肝脏形成过程中相互作用，这些知识的缺乏阻碍了肝脏发育的研究。本文发现了在肝脏发育过程中内皮细胞、间充质细胞和肝细胞的多样性，并进一步生成了一个完整的内皮细胞和肝细胞谱系的发育时间图谱。总之，本研究提供了一个全面的从内胚层和中胚层建立肝细胞谱系的单细胞图谱。原文下载链接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/33125890
scRNA-seq显示小鼠内胚层和中胚层肝细胞谱系
英文题目：Single-cell landscape of the ecosystem in early-relapse hepatocellular carcinoma 收集12例未经治疗的原发性HCC患者和6例早期复发性HCC患者的外科手术肿瘤样本和配对的癌旁组织，用细胞分选（FACS）分离CD45+和CD45-细胞。实验方法：scRNA-seq（10x）、samrt-seq2、bulk RNA-seq、流式分选、免疫荧光等
肝癌是全球癌症相关死亡的第四大原因。肝细胞癌（HCC）是最主要的肝癌形式，占患者的75%-85%。对于肝癌，手术切除是目前最有效的治疗方法，具有治愈潜力。然而，肿瘤复发的高发生率（术后5年50%-70%）阻碍了生存率的提高。此外，术后2年内的早期复发占复发HCC病例的70%，这种复发很少可以治疗，并且与不良生存期相关。但是目前，我们对于与肝癌术后快速复发相关的分子机制仍知之甚少。对肿瘤复发的深入探索可以提高我们对肿瘤发生和进展相关机制的理解，有助于发现更有效的HCC治疗策略，包括免疫疗法。在两个独立的队列中，与原发肿瘤相比，早期复发肿瘤的调节性T细胞水平降低，树突状细胞（DCs）增加，浸润性CD8+T细胞增加。值得注意的是，复发肿瘤中的CD8+T细胞过度表达KLRB1（CD161），并表现出类似先天性的低细胞毒性状态，克隆扩张程度低，这不同于原发性HCC中观察到的经典耗竭状态。研究表明，这些细胞的富集与较差的预后有关。差异性基因表达和相互作用分析揭示了复发性肿瘤细胞潜在的免疫逃避机制，该机制抑制DC抗原呈递，并招募先天性类似CD8+T细胞因此，该研究对HCC生态系统的全面描述为我们提供了与肿瘤复发相关的免疫逃避机制的更深层次的见解。原文下载链接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/33357445
scRNA-seq分析原发性和复发的肝癌肿瘤微环境英文题目：Single-cell atlas of hepatic T cells reveals expansion of liver-resident naive-like CD4+T cells in primary sclerosing cholangitis发表杂志：Journal of Hepatology 2021 11例原发性硬化性胆管炎(PSC)患者，2例非硬化肝和9例移植肝分选T细胞； 4例PSC外周血，4例正常人外周血for scATAC-seq;实验方法：scRNA-seq（CITE-Seq，10x ）、scTCR-Seq、scATAC-Seq、流式分选等
关于肝内免疫细胞的组成及其在原发性硬化性胆管炎(PSC)发病中的作用知之甚少。在这里，我们的目的是创建一个肝内T细胞图谱，从而对炎症的人肝脏中的T细胞进行深入的表征。 通过scRNAs-seq、scTCR-seq、scATAC-seq等技术分析了肝内T细胞，发现了一种以前未明确特征的肝脏驻留CD4 + T细胞，与健康肝组织和其他肝脏疾病相比，PSC患者的肝脏中CD4 + T细胞增多并向TH17细胞转化的趋势。这些细胞很可能参与了PSC的发病机制，并可能成为新的治疗方法的靶向。原文下载链接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/33774059
英文题目：Spatial Transcriptomics to define transcriptional patterns of zonation and structural components in the liver实验材料：8-12周的Female C57BL/6 mice，收集小鼠肝脏4个切片。实验方法：空间转录组测序（ST，10x ）、scRNA-seq等
哺乳动物的肝脏是维持机体代谢平衡和解毒的重要器官。它被认为是重要生物分子如铵、脂肪酸、氨基酸和葡萄糖的生成、交换和降解以及各种外来化合物和毒素的转化和消除的中心作用。近年来，通过单细胞转录谱重建异质性极大地提高了我们对空间肝脏转录组的理解。然而，在物理空间上，肝脏小叶单位的转录差异仍然难以捉摸。本文使用空间转录组学对肝组织切片进行转录组分析。我们证实，这种复杂组织的异质性主要是由小叶带决定的。通过引入新的计算方法，我们能够测量组织结构之间的转录梯度，包括不同方向的几个小叶。此外，我们的数据表明，在肝脏组织中存在以前转录未知的结构，有助于器官的整体空间异质性。这项研究表明，全面的空间转录组技术可以用来描述肝脏中广泛的空间基因表达模式，表明其未来对肝功能、发育和再生研究的影响，以及其在临床前和临床病理方面的潜力。
原文下载链接：https://doi.org/10.1101/2021.01.11.426100
在多细胞器官中，如人类肝脏，细胞的功能依赖于相邻的单个细胞类型之间相互作用的平衡，这导致了组织稳态。单细胞技术可以描绘不同细胞类型的分子异质性及其在疾病期间的变化。然而，如果没有空间背景，就不清楚这些不同的细胞类型如何协调组织功能。在这里，整合了空间转录组学、单细胞基因表达和染色质可及性数据，提供了心肌梗死早期和晚期与对照心脏(非移植供体心脏)相比的全面资源图。利用空间转录组学数据，可以研究细胞系和功能之间的联系，这是单细胞技术无法实现的。利用空间转录组和单细胞联合的策略提高细胞类型组成的空间分辨率，并通过识别损伤、修复和重塑的不同细胞区域，提供对肝脏转录组和表观基因组的空间分辨率洞察力，为进一步研究肝脏疾病的机制和治疗提供了参考。
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