微生物研究所发布2016年前三季度菌种鉴定分析报告
浙江省微生物研究所（浙江天科）对2016年前三季度（1~9月份）送检鉴定微生物进行了属水平相关的统计和分析，鉴定样品涵盖药品、食品、化妆品等行业，其中细菌占比84.6%，真菌占比15.4%。详细报告见下文。
对单个送样企业来说，送检样品可能会存在刻意性和选择性，但我们认为，当我们接收的样品数量足够大，涉及相关企业足够多的时候，即便是个体送样上存在选择性，最后汇总形成大数据进行分析时仍然具有代表性和普遍性，因而将相关数据整理发布，以供业内人员探讨交流。
※：其中1月份、9月份（G20峰会）受假期影响数据可能会有偏差。
特别说明 1、受送样鉴定方的选择，本报告仅对我所收样鉴定的菌种进行统计分析；
2、受地理位置的影响，目前送样方主要以江浙沪地区为主，向周边省市扩散；
3、本报告仅以菌属为对象进行统计分析，数据仅供参考，不作为其它相关分析报告依据；
4、本报告及相关数据未经授权不得转载或是引用作为商业用途。
作者：柳橙汁、车阳、王庭璋、陈欢
浙江省微生物研究所
朱征
美国粒子监测系统公司（PMS）
编辑/美工：静静、张力
一、前 言
洁净室为医药，食品，航空等许多工业环境提供了一个减少终端产品被微生物污染的清洁环境，保障了产品的清洁和安全。洁净室的维持有赖于日常的监控程序以及相应的维护措施。对洁净室监控发现的微生物种类、范围和模式进行研究，可以为微生物工作人员更好的了解洁净室的环境以及辅助微生物的控制提供必要的信息。
我们通过对洁净室微生物群落的了解，目的是为了建立洁净室正常状态的基线，并在此基础上，通过后续数据的录入，进行趋势分析等进一步工作。这也是EP、USP以及中国药典的要求。通过合适的鉴定手段对洁净室正常状态下菌群进行调研，用来指导清洁和消杀程序，对污染微生物进行有效溯源。
生产环境微生物群落鉴定的重要性还在于，通过相似而不同生产环境，不同洁净室的群落数据的比较，可以供微生物工作者更好的判断自身的环境是否处在良好的控制之下。
二、细菌属水平统计分析
常见细菌TOP10
※：我所在收样时不要求客户提供采样地点，故上表“常见来源”仅是根据菌群的常规生活习性做出的判断。
所有细菌占比饼图
（点击可放大，下同）
※：若要获取详细细菌分布数据，请私信索取。
三、细菌革兰氏属性分布
革兰氏染色是经典的反映细菌细胞结构的一种手段。革兰氏阳性菌细胞壁上含有多层的肽聚糖。而革兰氏阴性菌则有所不同，其表面有两层LPS细胞膜，但是无阳性菌复杂的肽聚糖细胞壁结构。
变形杆菌门（Proteobacteria）是细菌中最大的一个门，其下均为革兰氏阴性菌，包括一大部分的致病菌，LPS层包含着细菌内毒素的成分。
我所前三季度对收样鉴定微生物统计显示：革兰氏阳性菌占比为66.76%，革兰氏阴性菌占比为25.41%，详见下图：
细菌革兰氏属性分布饼图
四、真菌属水平统计分析
所有真菌占比饼图
图表可知真菌中最常见为青霉属和曲霉属
五、受季节变化菌属走势图
革兰氏阴性菌和阳性菌的比例通常能指示一个洁净环境的受控状态。运行良好的洁净环境通常是阳性菌为主要的菌群，如果细菌群落发生变化，就需要做更细致的调查，是哪些因素引起了变化。
从上图中可以发现4、5月份革兰氏阴性菌含量较高，之后下降，这可能和温度，湿度等季节性因素存在关联。也有报道显示，在丰水期水管路内检出革兰氏阴性菌比例上升，提示在这些时期需注意水系统管路等清洁是否到位。
六、部分常见微生物特性浅析
革兰氏阳性菌实际上在各个洁净生产环境都是最主要的分离到的微生物，不过具体的比例并没有一个广泛的研究。大多数在洁净环境分离到的微生物都是需氧或者兼性厌氧的嗜温微生物，这也和送检样品的统计基本一致。
只有在鉴定识别这些微生物后，才能有效的通过这些微生物的特性对其来源与风险，做出和自身实际相适应的判断。
下面根据统计的结果，对一些常见的革兰氏阳性菌（Staphylococcus、Micrococcus和Bacillus属）、革兰氏阴性菌（Ralstonia、Sphingomonas、和Stenotrophomonas属）以及常见的霉菌（Aspergillus属和Pencillin属）的特性进行一些浅析。
Staphylococcus spp.
葡萄球菌属是革兰氏阳性，不产孢子，兼性厌氧，不动，过氧化氢酶呈阳性或者阴性，呈球状，成对或者排列成葡萄串状。葡萄球菌属在动物身上和食物上都能存活，生长温度为7摄氏度到48摄氏度之间，最适生长温度为35摄氏度。pH最适范围为7.0-7.5摄氏度，不过在pH 4.5 也能生存。水活度方面，在低至0.8的水活度下也能生存，因此对盐和糖都有较高的耐性。
其中金黄色葡萄球菌（S. aureus）最为引人关注，因为该菌能够产生许多毒力因子，包括细胞表面的凝集素以及能够帮助其在组织中扩散的透明质酸酶，攻击宿主细胞的脱氧核糖核酸酶，天然抗氧化活性的金黄色色素类胡萝卜素等，此外该菌近年来还发现携带多种抗药性。
Micrococcus spp.
微球属为革兰氏阳性球菌，富含GC，基因组GC含量在65%-75%附近，通常能够从人的皮肤，动物身上分离到，喜欢少水或者高盐环境，嗜温。微球属不产孢子，但是生存力较强，能在冷冻环境和贫乏营养环境下生存较长时间。
代表性菌种为藤黄微球菌（Micrococcus luteus）。藤黄微球菌严格需要氧，不运动，过氧化氢酶阳性，不产凝集素，产黄色色素，对特定波长的UVA有吸收。和葡萄球菌属一样，在生产环境中的来源通常认为是人源。
Bacillus spp.
芽孢杆菌属为革兰氏阳性杆菌，一般为需氧或兼性厌氧，在环境恶劣时能产生芽孢，通常芽孢菌属在自然界中广泛分布，比如土壤等。
该属的Bacillus subtilis为模式生物，而其他物种可能和致病性相关。比如B. cereus通常是土壤里的腐生菌，就常在食物中（如肉、蛋中）发现，和食源性疾病如腹泻、呕吐相关（症状可能和金黄色葡萄球菌类似）。B. cereus通常并不是具有生存竞争力的生物，但是在热处理后的产品中，如果处理不当，会催生芽孢，而此时大部分常温下有竞争力的微生物被杀死，B. cereus失去竞争者后大量繁殖。B. cereus所产生的芽孢对于多种疏水表面有较高的黏附能力，控制方式是采样合适浓度的次氯酸盐溶液或者UVC照射处理。
Ralstonia spp.
罗尔斯通氏菌属属于β-变形杆菌门，革兰氏阴性杆菌，可运动，从植物，土壤和水中能分离到。和伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）属比较相似，但是在半乳糖，甘露醇，甘露糖和山梨糖醇的利用方式不同。
该属的Ralstoniapickettii在1970年的时候在医用无菌Modudose生理盐水作为污染菌被分离出来，和呼吸感染，血液感染相关。实际上该菌因为比较小，能透过0.2μm 无菌滤膜，因而在依赖于过滤除菌的产品生产中备受关注。建议生产医用溶液和其他液体产品的制造商在制作过程中防止该菌污染水系统，并将该菌的检测列入风险管理措施当中。
Sphingomonas spp.
鞘氨醇单胞菌属属于革兰氏阴性杆菌，不产孢子，严格需氧微生物，通常为黄色或者灰白色菌落。在环境中的分布和水比较相关，也在植物根系中发现。该属微生物能够在营养贫乏的环境中生存，能利用的碳源范围广。许多污染环境下分离出来的菌株表明，该属具有生物降解特性，能利用多种环境污染物作为碳源。当生产环境中出现鞘氨醇单胞菌属时通常需考虑水系统的清洁问题。
Stenotrophomonas spp.
寡养单胞菌属属于γ-变形杆菌门，革兰氏阴性，能够从土壤，植物，和动物上分离到。
Stenotrophomonas maltophilia（曾命名为 Pseudomonas maltophilia或Xanthomonas maltophilia）
近来被发现在医院的环境中和免疫功能不全病人有关，但是在健康人群尚无致病报道。该菌尚未列入控制菌，但是该菌能够形成生物膜，附着在医药用水系统当中，同时作为革兰氏阴性菌，其能够产生内毒素，是否列入控制范围应该要结合自身产品的实际情况去考虑。
Aspergillus spp.
曲霉属几乎是医药环境中最常见的污染菌，因为该属的菌能够产生多种酶类，降解利用多种底物，其中一些物种能够产生真菌毒素。该属菌的颜色，取决于分生孢子梗和分生孢子的数量。最适生长温度在20-25℃，喜好低pH含葡萄糖的培养基。
代表性的物种是黑曲霉（Aspergillus niger），分布区域跨越极地和热带。其分生孢子在空气和土壤中都存在。生长开始呈现白色丝状，后变成黄褐色，随着孢子的增殖迅速变成黑色，最适生长温度25℃，但是能够在50℃保持生存。因为分布广泛，经常导致产品腐败。黑曲霉常用来作为指示霉菌，用于方法验证等。
Pencillin spp.
青霉属和曲霉一样，属于非常常见的室内室外微生物。其得名原因源自于其颜色为蓝色或者绿色。分生孢子分布广泛，在医药生产环境中因为引起产品或者封装变色，因而被关注。
青霉属和曲霉属在医药生产环境的出现，通常指示着环境控制可能存在缺陷。比如湿度，HEPA过滤系统工作状态，不充分的消毒程序，或者水泄露的区域。
更多关于菌种释义以及菌落形态图也可参考公众号早前发布文章→→：看图识菌
七、消杀方案及建议
关于消杀我们也请到了美国粒子监测系统公司市场部的朱征老师针对洁净室的清洁和消毒给出了一些更专业的消杀方案。
美国粒子监测系统公司（PMS）1972年成立于美国的科罗拉多州宝德市。做为微污染监测领域全球技术的领导者，PMS为制药行业提供无菌保障的整体解决方案，包括在线环境监测，粒子监测，微生物采样及培养，消毒剂，清洁剂等产品。
如需了解更多信息，请与PMS中国市场部联系，021-61133600
1、概述:
根据微生物研究所发布的2016年前三季度企业送样鉴定菌种分析报告，前10位菌属来看：
操作人员作为最大的污染源，葡萄球菌属占据第一位是可以预见的，但同时也能从排名中看出芽孢杆菌属紧随其后，芽孢杆菌属属于革兰氏阳性杆菌，部分革兰氏阳性杆菌的重要特性是能够产生对不利条件具有特殊抵抗力的芽孢，所以芽孢杆菌性是比较难杀死的一类微生物，需要特别给予重视。而排名前十的除芽孢杆菌属外，其余全部都可归类到“细菌营养体”。
2、微生物的抵抗力:
USP<1072> Disinfectants and Antiseptics中提到微生物对于化学试剂的抵抗性从高到低如下表所示：
微生物的抵抗性（从高到低）
由上表可知细菌芽孢最难杀灭，然后是真菌孢子及营养体，最后是细菌营养体。
※：多数企业比较关注的是细菌芽孢，真菌，细菌营养体，故在上表中用红色做了标识。
病毒和分枝杆菌不在讨论范围。
3、消毒剂的种类:
按照PDATR70 Fundamentals of Cleaning and Disinfection Programs for AsepticManufacturing Facilities（2015 release）对于消毒用的化学试剂按照杀菌效果的不同，做了分类：
第一类，称为Sanitizers(清洁消毒剂)
清洁消毒剂通常在30秒—10分钟内对于于低水平的细菌营养体有一定的下降作用。此类消毒剂需要标注合适的接触时间。醇类是此类常见的消毒剂，如乙醇和异丙醇。
第二类，称为Disinfectants（消毒剂）
消毒剂比清洁消毒剂具有较高的杀菌效率，杀菌效率和接种量，接触时间相关。消毒剂通常能杀死细菌营养体，而不能对芽孢微生物起作用。例如季铵盐和酚。
第三类，称为Sporicides（杀孢子剂）
杀孢子剂可杀灭所有微生物，其杀菌效率和接种量，接触时间相关，既能杀死细菌芽孢也能杀死真菌。杀孢子剂通常包括次氯酸钠，过氧化氢以及过氧化氢和过氧乙酸混合物。
4、消杀方案的选择:
一个合理的有效的消杀方案，需要结合以上三类消毒剂：清洁消毒剂，消毒剂，杀孢子剂，并考虑以下几点：是否能够有效的遏制环境的恶化，是否会影响到药品的质量，是否会对厂房或设备带来腐蚀性和破坏性，是否安全。
5、关于清洁:
在某种程度上洁净室的清洁比消毒更重要，如果房间没有做好清洁，而只是一味的依赖消毒，房间实际是不干净的，这些所谓的“脏东西”，不仅会潜在对产品产生污染，还会大大影响消毒剂发挥作用，时间一长，洁净室微生物或粒子监测结果会有不良的趋势，进而导致微生物污染的失控。
在国外，如果在洁净室发生微生物污染超标的情况，通常首先采取的措施是清洁，再清洁。另外清洁还是法规的要求，FDAGMP中有大约20条的内容是关于清洁的。
6、消杀总结:
芽孢在环境菌中占有较高的比例，不容忽视；
合理的有效的消杀方案，需要结合三类消毒剂：清洁消毒剂，消毒剂，杀孢子剂；
考虑到残留风险，不同的待消毒表面需选择合适的消毒剂；
一定不要忽视清洁。
八、综 述
微生物广泛存在于自然界，绝大部分微生物对人体是无害的，但是在一些特殊的环境或产品中，微生物需受到非常严格的管控。尽管如此，微生物污染导致的不良事件仍不断发生。除人为的失误外，另一个主要原因是绝大部分企业采取的防控手段主要为环境的控制和环境的消杀，而没有从微生物本身的生物学特性上去考虑防控。例如在某个特定的环境，微生物的来源有多种可能，进入到这个特殊环境后不同的微生物的适应能力又有所差别，从而在这个环境中微生物的分布就会呈现时空的变化，包括优势菌、革兰氏阴、阳性等情况的变动。如果企业建有良好的环境微生物管控系统（规律性的采样，科学准确的鉴定水平等），通过种类、来源和趋势分析，不仅可以早期发现环境中的污染菌可能的来源、定向的消杀，还可以用于评估环境的控制水体。
我所作为一家科研机构和第三方检测机构，会定期发布检测或者研究过程中采集的环境微生物的鉴定统计分析结果报告，可用于和各家生产单位的环境微生物数据进行比对、参考。今后随着采集量的不断加大和数据分析的不断深入，还可以用于政府相关部门的参考决策。
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