CD4⁺ T 细胞亚群傻傻分不清楚？这份总结治愈你的「脸盲症」
最近魔都人民在清晨都要接受一波直击灵魂的拷问：请问你是什么垃圾？垃圾分类的话题热度持续不减，段子可以绕地球一圈，「是干是湿，让猪试吃，一吃便知」的「猪分类法」被不少分类困难症患者奉为圭臬。
对于广大科研 er 来说，CD4+ T 细胞的亚群分类难度丝毫不亚于垃圾分类。本文精心总结出各亚群的功能、表面标志物、转录因子、分泌的细胞因子及常规分类策略，这份鉴「胞」宝典值得收藏。
掌握特点
分类也能 so easy
▲▲▲Naïve CD4+ T 细胞经活化可以分化成不同的细胞亚群，各怀绝技，在适应性免疫反应中具有核心作用。这种活化需要 T 细胞受体识别抗原肽或主要组织相容性复合体（MHC）（下图 Signal 1），以及不依赖抗原的共刺激信号（下图 Signal 2）。
CD4+ T 细胞分化成特定亚群取决于抗原、TCR 信号的强度以及存在于胞外的细胞因子。已经确定的 CD4+ 辅助 T 细胞亚群包括 Th1、Th2、Th9、Th17、Th22 细胞以及滤泡辅助 T 细胞（Tfh）、调节性 T 细胞（Tregs）。每个亚群都表达独特的细胞表面受体、转录因子并分泌不同的细胞因子。
Tfh 细胞主要促进生发中心 B 细胞的存活和增殖、支持生发中心的发育，而 Th1、Th2、Th9、Th17、Th22 亚群均参与宿主对特定微生物病原体的防御。这些效应 T 细胞亚群所分泌的各种细胞因子有助于消灭外来病原体，并激活其他类型的免疫细胞。
免疫细胞的活动在一定程度上是由 CD4+ T 细胞中的一个独特的亚群来平衡的，这个亚群被称为调节性 T 细胞（Tregs）。Tregs 细胞擅长维持免疫自稳和自我耐受、抑制炎症并预防自身免疫性疾病的发展。这种促炎信号和抗炎信号之间的平衡至关重要，因为已经发现，过度或不适当的 T 细胞反应与过敏反应、炎症性疾病和自身免疫性疾病有关。
Th1 细胞
Th2 细胞
Th9 细胞
Th17 细胞
Th22 细胞
可能参与保护皮肤免于微生物感染
可能参与组织修复或重塑
可能导致皮肤炎症和自身免疫性疾病
细胞表面标志物有 CD3、CD4、CCR4、CCR6、CCR10、IL-6Rα、IL-21 R、IL-23R、TGF-β RⅢ；转录因子有 Batf、AHR、STAT3；分泌 IL-10、 IL-13、IL-21、 IL-22、TNF-α
Tfh 细胞
Treg 细胞
限制免疫反应的进行
维护免疫系统的体内平衡和自我耐受
抑制自身免疫疾病的发展
细胞表面标志物有 CD3、CD4、CD5、CD73/5'Nucleotidase、CD39/ENTPD1、CTLA-4、Folate Receptor4、GITR/TNFRSF18、IL-2Rα/CD25、Integrin αE/CD103、LAG-3/CD223、LAP、LRRC32/GARP、OX40/TNFRSF4/CD134、L-Selectin/CD62L；转录因子有 FoxP3、STAT5；分泌 Galectin-1、IL-10、IL-35、TGF-β1
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从分离到鉴定
开展研究的先决条件
▲▲▲R&D Systems® 提供两种形式的试剂盒用于分离、富集 CD4+ T 细胞。一种基于磁珠，另一种基于分离柱。
MagCellect CD4+ T 磁珠分离试剂盒利用负选原理分离 CD4+ T 细胞、Naïve CD4+ T 细胞或记忆 CD4+ T 细胞；或者使用两步法，即采用负选结合正选分离 CD4+ CD25+ 调节性 T 细胞。
该试剂盒的特点包括：
磁珠的结合力非常高；
磁珠在铁磁流体中没有磁性记忆，不会引起细胞损伤；
可在几分钟内分离到高纯度的细胞。
使用 MagCellect 小鼠 CD4+ T 细胞分离试剂盒（R&D Systems, Catalog # MAGM202）分离小鼠脾脏 CD4+ T 细胞。图 A 为分离前、图 B 为分离后的流式散点图。其中使用大鼠抗小鼠 CD3- Fluorescein 单克隆抗体（R&D Systems, Catalog # FAB4841F）和大鼠抗小鼠 CD4-PE 单克隆抗体（R&D Systems, Catalog # FAB554P）对所有活细胞进行双重染色。分离的小鼠 CD4+ T 细胞纯度达 94.12%。
MagCellect 也提供基于柱子的 CD4+ T 细胞富集试剂盒，纯度可达 84~94%。
R&D Systems® CellXVivo 免疫细胞分化和扩增试剂盒包含高品质蛋白和抗体的优化组合，以及用于体外分化免疫细胞的简单、可重复的操作方案。试剂盒可用于人或小鼠 Th1 细胞、Th2 细胞、Th17 细胞或调节性 T 细胞的分化。
该系列试剂盒的优点包括：
包含细胞分化扩增所需的所有试剂
保证产生一致且可靠的结果
使用 CellXVivo 小鼠 Th1 分化试剂盒（R&D Systems，Catalog # CDK018）对小鼠 Naïve CD4+ T 细胞处理 5 天（图 B 和 C）。而图 A 和 C 为未处理的对照样本。所有样本使用细胞刺激剂 (Tocris, Catalog #5476) 刺激后再用 IFN-g-PE 单克隆抗体（R&D Systems，Catalog # IC485P）和 IL-17-APC 单克隆抗体（Novus Biologicals, Catalog # NBP1-72027）（图 A、B）或 IL-4-APC 单克隆抗体（Novus Biologicals, Catalog # NBP2-52656）（图 B、C）染色，十字设门基于同型对照。
在 T 细胞分化后，通过分析细胞表达的表面受体、转录因子以及分泌的细胞因子可以鉴定不同的 CD4+ T 细胞亚群。
Bio-Techne 公司旗下两大品牌 R&D Systems® 和 Novus Biologicals® 可提供众多高品质的荧光偶联抗体用于检测不同的 T 细胞亚群。R&D Systems® 拥有数百个全球知名的独一无二的克隆产品，其中许多已通过 HLDA 研讨会用于建立 CD marker 的命名。
流式细胞术检测 CD4+ 人外周血淋巴细胞中 FoxP3 的含量。用 FoxP3-PE 抗体（R&D Systems, Catalog # IC8970P）和 CD4-Fluorescein 抗体（R&D Systems, Catalog # FAB3791F）对人 PBMCs 进行染色。为便于核内染色，使用 FlowX FoxP3 固定破膜缓冲液（R&D Systems, Catalog # FC012）对细胞进行固定破膜。十字设门基于同型对照抗体（R&D Systems, Catalog # IC002P）。
流式细胞术检测 CD25+ 人外周血中 FoxP3 的含量。使用 FoxP3-PE 抗体（R&D Systems, Catalog # IC8970P）和 CD25/IL-2 Ra-APC 抗体（R&D Systems, Catalog # FAB1020A）对人 PBMCs 进行染色。为便于核内染色，使用 FlowX FoxP3 固定破膜缓冲液（R&D Systems, Catalog # FC012）对细胞进行固定破膜。十字设门基于同型对照抗体（R&D Systems, Catalog # IC002P）。
流式细胞术检测 CD4+人外周血细胞经诱导产生的 Th1 细胞中 T-bet/TBX21 的变化。CD4+ PBMC 经 20 ng/mL 抗人 IL-4 多克隆抗体（R&D Systems，Catalog # AB-204-NA）和 10 ng/mL 重组人 IL-12（R&D Systems，Catalog # 219-IL）处理 5 天，诱导产生 Th1 细胞。用 IFN-g-PE 抗体（R&D Systems, Catalog # IC285P）和 (A) T-bet/TBX21- Alexa Fluor 488 抗体（R&D Systems, Catalog # IC53851 G）或 (B) Alexa Fluor 488 偶联的同型对照抗体（R&D Systems, Catalog # IC002 G）对细胞进行染色。为便于核内染色，使用 FlowX FoxP3 固定破膜缓冲液（R&D Systems, Catalog # FC012）对细胞进行固定破膜。
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除了多种荧光偶联抗体可选择外，R&D Systems® 还提供流式多色鉴定试剂盒用于 CD4+ T 细胞亚群的鉴定：
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