样本没有读值怎么破？ | 老司机聊 ELISA
酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是最基础的免疫学实验之一，相信很多科研狗都有过使用 ELISA 的经历。
ELISA 操作简单，不需要特殊仪器，一台酶标仪即可完成检测。看似简单，实则不然。ELISA 是个非常严谨、极考验操作者技巧和经验的实验，检测结果没有读值、高 CV 值、高背景等诸多问题也是兵家常事。
Bio-Techne 资深技术支持将在今后的文章中为各位看官列举了一系列 ELISA 常见问题以及解决方法。
查原因：为何样本没有读值
科研最悲催的结果莫过于，辛辛苦苦干一年，读板回到解放前。样本孔没有读值或读值极低是 ELISA 最常见的问题。其关键在于判断是 ELISA 试剂盒的问题，还是样本中目标蛋白表达量低。
Step 1：分析标准曲线的读值、标准曲线 R2 值、背景值高低等，例如，即使标准曲线最高值只有 1.2，但 R2 值为 0.999，这样的标准曲线同样可用；
Step 2：如果标准曲线正常，则可以排除 ELISA 试剂盒的品质问题，此时需考虑样本中目标蛋白的表达含量，从笔者多年技术支持经验来看，样本中目标蛋白表达量低是没有读值最常见的原因。
例如，热门炎症因子 IL-6，其正常表达量极低，在 R&D Systems® Quantikine® IL-6（货号：D6050）说明书第 10 页，SAMPLE VALUES 一章中有如下描述：
Serum/Plasma - Forty serum and plasma samples from apparently healthy volunteers were evaluated for the presence of human IL-6 in this assay. Thirty-three samples measured less than the lowest standard, 3.13 pg/mL. Seven samples measured between 3.13 and 12.5 pg/mL. No medical histories were available for the donors used in this study。
”由此可见，很多健康成年人的血清/血浆中 IL-6 的表达量显著低于 Quantikine® IL-6 的检测限（标准曲线范围：Sensitivity：0.7 pg/mL；Assay Range：3.1~300 pg/mL）。
插播一条小知识：
免疫学检测中 Sensitivity 和 Assay Range 的区别：
Sensitivity 指的是免疫检测产品的分析灵敏度，是基于零浓度基础上，区分从无到有的分辨能力；标准曲线检测（Assay Range）下限，即功能灵敏度，基于低浓度的基础上，区分从有到无的分析能力。
说人话就是分析灵敏度主要是用于定性的，即当检测的值低于标准曲线检测下限，高于 Sensitivity 时，提示样本中有目标检测分子，但是具体浓度不确定；当检测的值是在 Assay Range 范围内时，才是定性并且定量的。
从标准曲线的示意图来看，样本读值都落在平台期（下图绿色圆点）不如落到标准曲线中段（下图红线之间区域）准确，所以实验中，不是简单的判断是否有读值，还要确定读值是否准确。
当 ELISA 的 OD 值低于标准曲线最低值时，我们的报告中可标注「ND，non detectable」，或 <（标曲最低值）。
早预防：三招提前规避风险
对于样本没有读值的问题，如何提前做足功课防患于未然呢？资深技术支持给你支招：
通常来说，炎症因子正常情况下不表达，或是表达量极低，趋化因子表达量较高。所以提前查询天然表达量极为重要，查询方法有多种。
R&D Systems® 的 Quantikine® ELISA 的说明书，会在 SAMPLE VALUES 部分描述血清、血浆、细胞培养上清的天然表达量。以 Quantikine® IL-6（货号：D6050）为例，其中详尽地描述了在未刺激及刺激条件下，细胞培养上清中 IL-6 的表达量：
同时，也可以通过查询相关文献来获得不同模型、不同实验条件下炎症因子的表达量。然而不同实验条件，对于检测的结果也会有差异，所以文献结果仅供参考。
分析 SDF-1 及炎症因子的表达量[1]
此外，还可使用现有的第三方数据库来进行查询，比如梅奥医学中心（Mayo clinic），该网站会对大量临床相关的免疫因子做正常人群的检测，同样以 IL-6 为例，可见正常表达量低于 1.8 pg/mL，这是样本没有读值的主要原因。
例如 Human IL-6 Quantikine HS ELISA Kit（货号：HS600C），Sensitivity：0.09 pg/mL，Assay Range：0.2 - 10 pg/mL。也可以在检测时设置阳性对照，可自行使用 PHA 刺激细胞后收集上清，或是购买对应的质控品 Human IL-6 Controls (optional，R&D Systems®，Catalog # QC01-1)。
免疫学检测样本的保存和处理非常关键，保存不当容易导致检测蛋白降解。当我们获得样本后，需要进行离心 1,000 x g 10 min，及时分装冻存于 ≤ -20 °C 条件下，并避免反复冻融。还需避免样本出现溶血、污染等问题，若发现样本中有大量絮状沉淀，应通过离心等方法尽力去除，以免影响检测结果的准确性。
对于炎症因子检测：在前期实验条件摸索过程中，可进行多个时间点采样检测，因为炎症因子在体内表达的半衰期不同，同时间点采样，有可能出现炎症因子表达丰度下降而无法检测。
此外，血浆样本抗凝剂的使用也需慎重：使用不当也有可能产生假阳性或假阴性。比如血浆中的肝素可能会吸附某些细胞因子，导致低值。在选择试剂盒时，厂家通常会标注进行过独特抗凝剂的验证，比如 Quantikine® IL-6（货号：D6050）就可以用于检测 EDTA、肝素以及柠檬酸盐抗凝剂处理过的血浆样本。
工欲善其事必先利其器，选择合适的 ELISA 试剂盒是实验成功的关键。
不同的 ELISA 试剂盒，在前期研发时会验证用不同的样本类型，如 Quantikine® IL-6（货号：D6050），验证的样本类型有细胞培养上清、血清、EDTA 血浆、肝素抗凝血浆和柠檬酸盐血浆。
若您购买的 ELISA 试剂盒说明书上没有验证过特定的样本类型，就不能使用吗？不一定，前人栽树后人乘凉，文献中可能已经验证过。在你自行验证时，就有了很大胜算。
这里教大家一个快速查找相关文献的小妙招：作为 ELISA 金标准的 Quantikine® 系列，是经过了无数种属和样本类型考验的。以 Quantikine® IL-6（货号：D6050）为例，当在 R&D Systems® 官网上搜索货号 D6050 后，可以在「Citations」部分找到大量的最新发表文献：
当你检测的样本类型在所选试剂盒未经验证时，则需要自行实验验证，主要是通过线性稀释实验和掺入回收实验来完成，至于这两个实验如何操作，请听下回分解。
参考文献：
Kristocheck M, et al. The homing of bone marrow stem cells is differentially activated in ischemic and valvular heart diseases and influenced by beta-blockers. J Transl Med. 2018 May 21;16(1):133.