如何有效建立肿瘤模型？两篇 Nature 给你支招
说到现在最火热的肿瘤体内和体外模型，病人来源的异体移植（PDX）和类器官（Organoid）模型毫无疑问分别是这两个领域炙手可热的明星。
一方面可以模拟肿瘤的发展进阶过程；
另一方面可以重现肿瘤与微环境的相互作用，成为近年来高分文献的常客。
如何建立这两种模型走好肿瘤研究的第一步？两篇 Nature Protocols 来支招。
数十年的临床实践证明，以细胞系为主体，以皮下注射为主要移植位点的体内模型系统的预测能力极低。通过这种临床前研究得到的备选药物临床转化失败率高达 90% 以上，这也是肿瘤药物研究时间长成本高的原因之一。
病人来源的异体移植（Patient Derived Xenograft, PDX）模型应运而生，该方法是将病人原代组织以组织碎片或分散成细胞悬液的形式移植到免疫缺陷小鼠（常用裸鼠/SCID 小鼠）或人源化小鼠的体内。这种模型系统筛选得到的药物在一些临床试验中反应率可以高达 90% 以上，具有极强的预测性。
PDX 模型不仅能准确反映肿瘤的瘤间异质性、瘤内异质性、药物敏感性，还能反映出肿瘤在体内发展和进化的过程，如果种植在原位（Orthotopic），还能进行肿瘤转移的研究，是极佳的研究材料。
在体内成功成瘤这一关键问题上，早在 1990 年，研究人员就发现人小细胞肺癌细胞与基底膜提取物/基质胶（Cultrex Basement Membrane Extract , BME）混合后注射到无胸腺的小鼠中，成瘤效果更好。
随后，陆续有报道表明乳腺癌、结肠癌、胰腺癌等肿瘤组织/细胞与 BME 的混合注射可显著提高成瘤率。有研究表明，采用该混合注射法，可以直接使用癌症干细胞、肿瘤细胞建立 PDX 模型[1]。
SCID 免疫缺陷小鼠皮下注射（a）100 μL 未稀释的低生长因子、不含酚红的 BME 和 2×105 PC3 前列腺癌细胞混合物或（b）不含 PC3 细胞的 BME，9 天后，前者肉眼可见前列腺肿瘤和血管浸润。（c）对内皮细胞标志物 CD31 的表达进行 IHC 染色（箭头），揭示肿瘤内的血管化程度。
BME 促进成瘤的秘密是什么呢？
这要回归到它的结构和成分：
BME 是从富含细胞外基质（ECM）的小鼠滑膜肉瘤（EHS）中提取的基底膜基质，可以为肿瘤细胞的生长提供支撑，促进肿瘤细胞的运动；BME 的主要成分包括层粘连蛋白、胶原蛋白 IV、巢蛋白和硫酸乙酰肝素等，还含有各种生长因子、细胞因子、蛋白酶及其抑制剂，这些组分都可以促进肿瘤细胞的生长、黏附和增殖。
2012 年的 Nature Protocols 发表的方案，推荐使用不含 LDEV（乳酸脱氢酶增高病毒）的 BME（R&D Systems®，Type 1 型 2D & 3D 细胞培养通用版本，货号 3432-005-01）和促进异种、肿瘤移植细胞生长的 BME（R&D Systems®，Type 3 型，模拟体内肿瘤生长的生理环境：低葡萄糖、低 PH，货号 3632-005-02）来建立 PDX 模型[1]。
整个实验需要 2~4 小时。该过程能够从细胞或活检材料中生长出肿瘤，并具有更高的获取和生长效率，可以保留基于组织学的原发性肿瘤表型。与其他细胞类型共同注射可提供更多人类癌症的生理模型，用于药物筛选和研究肿瘤生物学。以下是该文章提供的详细实验经验。
不同的实验所需的细胞数量各有不同，与如下因素相关：
肿瘤细胞类型（缓慢生长 VS 转移型，是否含其他细胞）；
注射部位（皮下或原位）；
小鼠类型（低免疫缺陷型-Nude VS 高免疫缺陷型-NSG）。
建立 PDX 模型所需细胞的数量和注射的体积如下表所示：
与 BME 共注射的细胞、细胞数、接种小鼠、接种部位列表[1]
随着干细胞技术的发展以及分化机理的阐明，类器官技术日渐获得关注。除了在再生医学上的应用之外，肿瘤研究才是类器官技术发挥的主战场。
以 iPS/ES 或成体干细胞为起点，在 BME 提供的 3D 环境下，利用细胞因子将干细胞分化成具有各种器官主要组织细胞类型及组织特征的微型结构。
类器官优势
虽然是一种体外培养方法，但类器官在很大程度上可以模拟体内的生理环境，具有众多优势：
其一，PDO（Patient Derived Organoid）对于候选药物有较高的预测能力，且适用于高通量培养，因此可以用来建库，作为有效的药物筛选平台；
其二，由于类器官的生长时间较短（数周），可以用作临床试验或患者用药指导的工具，具有开发成精准诊断平台的潜力；
其三，由于类器官是由单一干细胞分化而来的，作为分化前体的干细胞可以经过各种基因编辑或转基因技术的改造，用于研究肿瘤的发病机理。
类器官用于个性化癌症治疗和药物开发示意图[2]
2018 年，《Science》上发表了一项关于类器官药敏测试的临床应用研究。通过利用体外培养出的肿瘤类器官进行化疗药物敏感性测试并用于指导临床用药，与患者实际疗效进行对比，发现在预测抗癌药物的有效性上，类器官具有 100% 的敏感性，93% 的特异性，88% 的阳性预测值以及 100% 的阴性预测值[3]。
如何建立类器官模型？
以结构复杂的胃为例，人的胃包含两个主要区域：胃底上皮的胃体和胃窦。
James M. Wells 等人使用人多能干细胞（hPSCs）分化成人胃类器官（hGOs），该类器官具有胃窦或胃底上皮的结构，在细胞成分、组织架构及特定功能等方面与正常胃高度的相似[4]，可应用于胃的形成与生理、疾病机理研究、药物筛选与开发以及再生医学等领域。
作者对胚胎胃发育相关的信号通路进行了逐步调节：实验流程中都使用了 Activin A（R&D Systems® ,338-AC），然后使用 FGF-4（R&D Systems®, 235-F4）、Wnt 通路激动剂 CHIR99021（Tocris, 4423）、BMP 通路拮抗剂 Noggin（R&D Systems®, 6057-NG）和维甲酸来形成 3D 前肠后球体。包埋在基质胶中的球体在含有 EGF（R&D Systems®, 236-EG）的培养基中生长 4 周后可以形成胃窦类器官（hAGOs）。为形成胃体类器官（hFGOs），球体培养时还需要添加 CHIR 和 FGF-10（R&D Systems®, 345-FG）。而诱导 hFGOs 中形成泌酸腺体细胞需要在 30 天的时候进行 48 小时的短暂 BMP-4（R&D Systems®, 314-BP）和 MEK 抑制剂 PD0325901（Tocris, 4192）的处理。整个实验总计需要 34 天[4]。
包括体内和体外模型系统的构建在内的肿瘤研究是系统化的工程，只有多中心多机构的联合才能帮助我们完成这个工程，攻克肿瘤，创造生物医学领域新的里程碑。
Bio-Techne 的金标准 ELISA 试剂盒、高品质的重组蛋白、独创的黑科技 Prodots® 蛋白小球、数量业界领先的抗体期待与你联合制敌。
欲了解更多产品详情，请联系 Bio-Techne 销售或者各地授权代理商。
参考文献向上滑动阅览
1.Rafael Fridman, et al. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nature Protocols. 2012 volume 7, 1138–1144.
2.Drost J, Clevers H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 2018 Jul;18(7):407-418.
3.Georgios Vlachogiannis, et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.Science. 2018 Feb 23; 359(6378): 920–926.
4.Taylor R. Broda, et al. Generation of human antral and fundic gastric organoids from pluripotent stem cells. Nature Protocols.2019 volume 14, 28–50.