什么时候该用摇床？又该怎么选？ | 老司机聊 ELISA

Shaker or no shaker，是 ELISA 实验中会遇到的一个问题。

大多数的 ELISA 实验是不需要使用摇床的，室温孵育即可，但 ELISA 种类繁多，某些特殊的 ELISA 不但需要摇床，对摇床本身参数要求也较为严格，今天 Bio-Techne 资深技术支持就给大家介绍一种特殊的 ELISA 及其所需的摇床——竞争法 ELISA。

什么是竞争法 ELISA

根据预包被的是抗原或抗体，可以分为直接竞争法和间接竞争法。

● 直接竞争法（包被抗体）

将抗体包被在固相载体上，加入 HRP 标记的抗原及待测样本。若待检测样本中含有抗原，则将与 HRP 标记的抗原竞争性结合板上的抗体。

直接竞争法实验流程

● 间接竞争法（包被抗原）

将抗原包被在固相载体上，加入待测样本和 HRP 标记的抗体。若待测样本中含有抗原，则将和板上的抗原竞争性结合加入的 HRP 标记抗体。

因此，待测样本中表达的抗原浓度越高，OD 值越低，如下图所示：

这个过程类似于抢椅子游戏，以直接竞争法来说，先由检测样本中的抗原抢到椅子，再由 HRP 标记的抗原去抢空余的椅子：

凭本事占的座，说啥也不让！

竞争法 ELISA 的优势在于特异性高，适用于检测分子量较小的分子，如前列腺素、cAMP、一氧化氮、皮质醇等。

而且因为不同物种之间的小分子结构相似度高，所以竞争法 ELISA 通常不会标记检测物种，以 Prostaglandin E2（R&D Systems^®，货号：KGE004B）为例，发表文献中检测的物种有：

直接竞争法通常比间接竞争法具有更高的灵敏度：直接法中 HRP 标记的抗原和样本中待检测的抗原都是处于液相，他们与抗体的结合几率是相同的；而间接法中，固相的抗原和液相样本中抗原结合抗体的环境不同，导致结合的几率也不相同。

R&D Systems^® 的竞争法 ELISA 主要采取的是直接竞争法 ELISA。点击查看 R&D Systems^® 竞争法 ELISA 试剂盒。

cAMP 含量测定，cAMP assay (R&D Systems^®，货号 KGE002) 检测不同样本类型 cAMP 浓度。

为什么竞争法 ELISA 离不开摇床

在实际操作中，经常有盆友会遇到竞争法 OD 值低的问题，久经沙场的老司机的个人经验是，大部分原因在于摇床没有选好。

首先我们看下在 ELISA 孔中的微观世界到底发生了什么：

对于 ELISA 来说，在微观的固相和液相之间，会形成一层边界效应的界面，这层界面会在一定程度上影响到抗原和抗体的充分结合。

对于竞争法 ELISA 来说，充分的抗原抗体结合是得到理想结果的关键，因此，竞争法 ELISA 与经典双层夹心法 ELISA 不同点就在于要使用摇床，让微观环境下的抗原抗体能更加充分的结合。

如何选择合适的摇床

通常说明书上会有如下要求：Horizontal orbital microplate shaker (0.12" orbit) capable of maintaining a speed of 500 ± 50 rpm，即轨道直径为 0.12 英寸（3 毫米）的微孔板水平摇床，速度 500 ± 50 rpm。

平时大家在选择摇床时，只会注意摇床的转速，即 500 ± 50 rpm，殊不知对于竞争法 ELISA 来说，摇床的轨道直径也同样重要。

轨道直径为何物呢？也就是摇床的振幅，指托盘在做圆周运动时候的直径。根据 R&D Systems^® 的开发经验，推荐 0.12" 轨道直径的摇床，使用此振幅的摇床可以得到更优的实验结果。

如果实验室里的摇床轨道直径不符合说明书要求，建议先进行预实验观察效果。不过为了得到稳定重现性的结果，我们强烈建议您使用正确的摇床。

案例分享

最后给大家分享一个真实的案例，有位童鞋在做竞争法 ELISA 的预实验过程中，发现整体的 OD 值很低、标曲读值低且不成线性，下表中黄色部分为标曲，灰色为 NSB（non-specific binding）。

通过问题排查，排除了实验者本身的实验操作问题，且发现摇床的轨道直径不达标，怀疑是它导致了孵育时抗原抗体结合不充分。后续实验更换了正确的摇床后该童鞋反馈，ELISA 实验的几个重要指标，最高标准品的 OD 值、曲线拟合度 R² 值、NSB 值等，都有完美的体现。

总的来说，摇床对于竞争法 ELISA 实验较为重要，需要注意摇床的使用与型号的选择。对于其它类型的 ELISA 如夹心法 ELISA，若说明书没有特殊要求进行摇床震荡，则不需要特意使用摇床。

往期精彩推文推荐：