新冠病毒感染肠道实锤？看类器官模型如何佐证

ACE-2，已经是公认的 SARS-CoV-2 入侵人体的关键靶标之一。SARS-CoV-2 通过 Spike-蛋白与 ACE-2 结合的分子机制来感染宿主细胞^[1,2,3]。近日，高福院士等人从康复的新冠肺炎患者体内发现两种单克隆抗体，可以与ACE-2结合，有效降低受感染小鼠肺部的新冠病毒滴度^[4]。

ACE-2 亦称为 I 型金属羧肽酶，是 ACE 的异构体，在肾素-血管紧张素系统中发挥关键的作用，还可以作为高血压治疗的重要靶点^[5]。ACE-2 在心脏、肺、肾脏和肠胃中都有表达，所以通过该靶点进行感染的病毒不但会在呼吸道中引发病变，还能在消化道中肆虐^[6,7]。

临床上，也发现了一部分具有肠道症状的患者^[8]，此外，在呼吸道症状得到缓解且鼻咽拭子为阴性后很长时间，仍能在人粪便中检测到 SARS-CoV-2，表明病毒还可以通过所谓的「粪便传播」方式进行扩散，所以直肠拭子检测病毒 RNA 也是诊断标准之一^[9]。但是，目前尚缺乏直接证据，证明 SARS-CoV-2 可以感染肠道细胞。

构建类器官模型，一探究竟

怎么验证肠道细胞是否易感呢？荷兰皇家艺术与科学院 Hans Clevers 团队与 Erasmus 医学中心的 Bart L. Haagmans 于 5 月 1 日在 Science 上在线发表了题为「SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes」的文章^[10]。
该研究基于人小肠上皮类器官（hSIOs）模型，通过共聚焦和电子显微镜在其中发现了大量的传染性病毒颗粒。mRNA 表达分析揭示了常规病毒反应程序被强烈诱导激活。本文确认 SARS-CoV-2 可以感染小肠上皮细胞并进行有效复制，而 hSIOs 模型也可作为冠状病毒感染研究的实验工具。
研究首先验证了病毒对 2D 培养的类器官衍生的人气道上皮培养物的侵袭，发现 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 容易感染分化的气道培养物。免疫染色显示病毒主要针对有纤毛的细胞，而不是杯状细胞。
SARS-CoV 和 SARS-CoV2 感染 2D 培养的人气道培养物。病毒核衣壳（红色），含纤毛细胞（绿色），杯状细胞（蓝色）。
随后使用了 3D 培养的原代肠上皮干细胞来源的 hSIOs，类器官包含所有体内上皮中增殖和分化的细胞类型。让类器官在四种状态下培养：

• EXP：高 Wnt 含量的扩增培养基
  

• DIF：分化培养基
  

• DIF-BMP：额外添加了 BMP-2/4 的分化培养基
  

• EEC：含肠上皮细胞、杯状细胞和少量肠内分泌细胞的分化培养基
  

这里分享 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 感染类器官的操作过程：

1. 用冷的 AdDF+++收获类器官，以去除包埋的 BME（Hans Clevers 常用：R&D Systems^®，Cultrex^® BME，货号 3533-005-02）；

2. 在上述培养基中用巴氏吸管分离分化和未分化的类器官，分别用 AdDF+++清洗一次；

3. 在扩增或分化培养基中培养，使用病毒在 37°C 5% CO₂ 的环境中中感染 2 小时，随后用 AdDF+++洗去多余病毒；
   

4. 将类器官重新包埋在 30μL BME 中，置于 24 孔板上进行培养，每个孔再加 500μL 扩增或分化的培养基，37°C 5% CO₂ 条件下进行培养。
   

最终在四种培养状态下，SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 感染后都可以检测到较高滴度的病毒水平。
注：AdDF+++：Advanced DMEM 3 supplemented with GlutaMax, HEPES, penicillin (10,000 IU/mL) and streptomycin (10,000 IU/mL)

SARS-CoV-2 感染 3D 培养的 hSIOs。其中检测 ACE-2 表达采用的是 R&D Systems^® 的中和抗体（货号 AF933，C 图）。该抗体除了可以检测 ACE-2 的表达，还可以阻断 S-蛋白和 ACE-2 受体的结合。
以上结果证明 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 可以有效感染人气道上皮细胞和小肠类器官。

回归治疗与研究，有何启示

为了找到一些治疗的线索，研究人员通过 RNA 测序研究了肠道细胞对病毒的反应。发现了 I 型和 III 型干扰素通路相关的细胞因子和干扰素刺激基因（ISGs）被强烈地诱导上调，已知这些基因可以抵抗病毒感染，未来有望用于开发新的治疗方法。
SARS-CoV-2 感染的肠道类器官的转录组学分析
此外，通过不同培养条件来调整 hSIOs 中细胞 ACE-2 的表达，发现其表达水平的高低对 SARS-CoV-2 对肠上皮细胞的感染率影响不大，较低的表达就可以保证病毒的侵入。

总之，该研究表明 SARS-CoV-2 可以在消化道细胞中繁殖，与最近其他研究一致，COVID-19 患者存在肠道传播的可能，因而在患者中进行直肠拭子或粪便样本进行广泛的测试是有一定意义的。同时，类器官在此项研究中可谓功不可没，因而可以作为研究病毒感染的有效模型。

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❖ 相关研究工具：

病毒相关蛋白	表达系统	状态/货号
SARS-CoV-2 N His	Sf21（baculo）	即将发布
SARS-CoV-2 RBD Fc	HEK293	即将发布
SARS-CoV-2 Papain-like protease	E. coli	E-611
Recombinant Human ACE-2 His(Rat and Mouse also available)	NS0	933-ZN
Recombinant Human CD147 Fc Chimera	NS0	972-EMN
Recombinant Human Aminopeptidase N- His(Mouse also available)	NS0	3815-ZN
Recombinant Human DPPIV/CD26 (Mouse also Available)	NS0	9168-SE
类器官用BME基质胶	货号	规格
Cultrex Reduced Growth Factor Basement  Membrane Extract, Type 2, Pathclear	3533-001-02	1 mL
3533-005-02	5 mL
3533-010-02	10 mL
培养用细胞因子	表达系统	货号
Recombinant Human/Mouse/Rat BMP-2 Protein	CHO	355-BM
Recombinant Human BMP-4 Protein	NS0	314-BP
抗体(可用于检测和中和)	应用	货号
Human ACE-2 Antibody	B/N. Flow, IHC, IP, Simple Western, WB	AF933

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参考文献：

1.The L. 2020. Lancet.

2.Zhu N. et al. (2020) N Engl J Med.

3.Chan JF. et al. (2020) Emerg Microbes Infect. 9: 221-36.

4.Yan Wu, et al.A Noncompeting Pair of Human Neutralizing Antibodies Block COVID-19 Virus Binding to Its Receptor ACE2. Science (2020).

5.Rota, P.A. et al. (2003) Science 300:1394.

6.Harmer, D. et al. (2002) FEBS Lett. 532:107.

7.Leung, W.K. et al. (2003) Gastroenterology 125:1011.

8.J. Gu, B. Han, J. Wang, COVID-19: Gastrointestinal manifestations and potential fecal-oral transmission. Gastroenterology 158, 1518–1519 (2020).

9.W. Wang, Y. Xu, R. Gao, R. Lu, K. Han, G. Wu, W. Tan, Detection of SARS-CoV-2 in different types of clinical specimens. JAMA (2020).

10.Mart M Lamers, et al. SARS-CoV-2 Productively Infects Human Gut Enterocytes. Science (2020).