肝胆肿瘤分子诊断临床应用专家共识（2020）
分子生物学诊断技术已广泛应用于包括肝细胞癌（HCC）、胆管细胞癌（CCA）、混合癌（HCC-CCA）在内的原发性肝癌（PLC）及胆管癌、胆囊癌等原发于胆系的恶性肿瘤的临床诊断、疗效评估、预后判断等各个方面。鉴于现有的包括酶联免疫吸附（ELISA）、免疫组化、基因芯片、基因测序在内的诸多实验手段易受标本采集、保存、核酸提取、测序深度、试剂和仪器质量、结果分析判读等许多因素的影响，国内外相关学会已相继出台部分共识及指南，以推动分子生物学前沿成果在临床中的应用。为了完善和规范肝胆肿瘤相关分子生物学诊疗技术及临床实践应用的各个环节，进一步提升其临床效能的发挥，我们在系统总结临床及转化医学研究进展的基础上，结合我国实际，经过多次讨论形成了本共识。本共识旨在为肝胆肿瘤的分子诊断提供规范及建议，并为推广分子生物学诊断技术的临床标准化应用奠定基础。
一、诊断相关的主要分子标志物
专家推荐意见
（1）建议使用血清学AFP、AFP-L3以及DCP联合检测，结合患者影像学表现，作为临床HCC筛查、诊断的标志物。
（2）建议结合组织形态学，病理组织检测HepPar-1、精氨酸酶-1、GPC-3和AFP，作为HCC诊断的免疫标志物；联合应用GPC-3、热休克蛋白-70和谷氨酰胺合成酶作为早期HCC临床病理诊断（3项免疫标志物中2项阳性）的免疫标志物；CK7、CK19和黏蛋白-1作为CCA临床病理诊断的免疫标志物。
（3）建议使用血清学糖类抗原19-9、125及癌胚抗原联合
检测，结合影像学特点作为CCA临床诊断的标志物。
（4）建议使用血清学糖类抗原19-9检测，结合影像学特点作为胆囊癌临床诊断的标志物。
（5）ctDNA、微小RNA等血清学标志物，由于检测成本较高，且缺乏大规模临床试验结果论证，缺乏组织和肿瘤特异性特征，建议可作为肝胆肿瘤患者诊断及筛查的参考指标。
（6）建议肝胆肿瘤根治性治疗术后，参考使用上述血清学标志物结合影像学检查进行动态监测。
二、 治疗相关的标志物
专家推荐意见
（1）整体来说，对于肝胆肿瘤，无论靶向治疗（索拉非尼、仑伐替尼、瑞戈非尼等）还是免疫治疗（PD-1单抗、PD-L1单抗、CTLA-4单抗等），均无明确的标志物能够预测患者疗效和预后。临床实践中，不推荐在靶向治疗或/和免疫治疗前常规行基因筛查检测。
（2）HCC靶向治疗（索拉非尼、仑伐替尼、瑞戈非尼等）前，不推荐常规进行基因筛查预测疗效，但可结合临床实际情况或临床试验，对患者进行RAS、MET、HRD、VEGFA等基因检测，为HCC耐药后治疗以及联合治疗提供参考依据。
（3）临床中可结合实际情况或临床试验，尝试对CCA/胆囊癌患者进行FGFR、ERBB2、BRAF、IDH、HRD、PI3K/mTOR、FGF19等基因检测，探索患者个体化靶向治疗的新方案。
（4）肝胆肿瘤免疫治疗前（PD-1单抗、PD-L1单抗、CTLA-4单抗）不建议通过常规基因筛查选择免疫治疗优选人群。但可结合临床实际情况或者临床试验，对患者进行组织学或血清学PD-L1、TMB、MSI等检测，探索免疫治疗有效的分子诊断标志物。
（5）所有标志物的检测，仅为肝胆肿瘤靶向和/或免疫治疗提供临床参考。由于肝胆肿瘤基因异质性、个体差异性、免疫微环境等多种影响因素存在，即使是由具有分子生物学背景、临床经验丰富的资深医师指导治疗，亦无法保证所有患者的临床获益。迫切需要开展多中心、大规模临床试验，以明确肝胆肿瘤靶向和/或免疫治疗过程中的有效分子标志物。
三、 肿瘤标志物的检测质控
3.1 血清肿瘤标志物
国家卫生行业标准《常用血清肿瘤标志物检测的临床应用和质量管理》规范了各种标志物的应用以及质控、报告的注意事项等各个方面，应注意患者进行血液样本采集时的生理变化、疾病情况、不良嗜好以及用药情况等。血液样本应避免溶血、样本污染。采集后应及时处理，根据需要选择储存条件，避免反复冻融。肿瘤标志物检测的方法很多，肿瘤标志物的连续检测、判断疗效或复发监测时应使用同一检测系统进行，以保证测定结果的可比性。实验室要求详见：临床实验室室间质量评价要求（GB/T20470）、室间质量评价结果应用指南（WS/T414）、临床实验室对商品定量试剂盒分析性能验证（WS/T420）及临床检验定量测定项目精密度与正确度性能验证（WS/T492）等。
3.2 病理免疫组化
（1）病理申请单上应包含患者的基本信息、采集标本的部位、方法（穿刺、活检、手术等），尽可能将肿瘤标本在离体30 min以内完整送达病理科进行切开固定。
（2）注意使用试剂的保存（避免反复冻融、污染等），建立组织处理、免疫组化切片、抗原修复、染色操作等的标准化流程。
（3）严格按照相关分级标准进行结果判定，最大限度规避因主观因素造成的结果差异。
（4）病理报告建议除常规病理结果、免疫组化结果、典型图片外，建议包含与肝脏恶性肿瘤潜在药物靶点检测、生物学行为评估以及预后判断等相关的分子病理学结果。
3.3 二代测序（NGS）实验过程及检测报告的要求
实验过程的要求
（1）NGS需建立并遵循流程质量管理体系文件，便于查询及追溯。
（2）NGS实验室需制定防污染措施及控制。实验室操作应符合《实验室生物安全通用要求》（GB19489-2008），进行定期通风及紫外照射处理。实验操作过程中，要严格执行各区功能划分、擦拭实验用品等避免交叉污染。
（3）NGS分析过程样本质量要求。A接收样本类型可选用福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）样本、新鲜组织、各种体液上清液、体液离心细胞块、石蜡包埋标本和血浆/血液标本等。B样本接收后需由病理专业人员对其进行检查，以进一步明确样本取样来源及肿瘤含量占比。C核酸提取：需使用经过验收合格的试剂对检测类型进行抽提。实验耗材应一次性使用，避免污染。抽提好的DNA需经过凝胶电泳、定量等鉴定其结果是否满足后续测序。D构建文库：将提取合格的DNA进行文库构建，对其进行目的基因的抓取，得到的文库进行质检查看其峰形及总量的占比。E测序上机：添加质控样品作为参照，选取合适的测序平台及芯片对样本进行测序。
检测报告的要求
（1）阳性变异判读。明确阳性变异位点，包括点突变、插入缺失、拷贝数变化及结构变异等。尤其是对于串联重复序列的插入缺失突变；构建自己实验室内部的假阳性数据库，有效剔除假阳性；规范命名，命名建议遵循人类基因组变异学会命名规则。
（2）变异分类。筛选临床相关变异：A明确变异分类的标准，包括已知报道变异、新发变异等。B依照临床证据对变异的肿瘤相关性（治疗、诊断、预后）分析，证据等级评定。
（3）对临床意义明确变异进行详细解释。A结合证据等级进行用药推荐（国内外相应规范，专家共识等），变异功能注释做到客观、准确、严谨。B报告的基本内容板块可以参考《临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识》中的结果解释及报告。C. 复核是否有文字错误。
（4）其他。对于动态监测的患者，需结合既往NGS检测结果比较分析。
四、小结
结合HCC患者基因表达、突变水平，推荐将HCC分为增殖型和非增殖型。增殖型HCC一般具有HBV感染的背景，且AFP很高，肿瘤进展更快、恶性程度更高，患者预后更差。非增殖型HCC一般是由于HCV感染或酒精性肝病所致，患者预后相对较好。另一方面，联合患者体内TMB与T细胞炎症基因（PD-L1、CTLA-4等）水平，可将肝胆肿瘤免疫微环境分为4型，其中以高TMB、高炎症细胞浸润为特征的1型微环境肿瘤，对于免疫治疗效果最佳，而以低TMB、缺乏炎症细胞浸润——“免疫荒漠”为特征的2型微环境肿瘤，对于免疫治疗疗效最差。此外，肝胆肿瘤免疫治疗中，我们还应关注肿瘤免疫治疗中超进展的情况（HPD）。数据显示，肿瘤免疫治疗中HPD发生率在10%左右，MDM2、MDM4、EGFR及11q13区间（包含CCND1、FGF19、FGF3、FGF4）基因扩增可能与肿瘤免疫治疗HPD相关，肝胆肿瘤免疫治疗HPD发生率、预测标志物等还需要进一步研究观察。
执笔专家：陆荫英（解放军总医院第五医学中心），赵海涛（北京协和医院），程家敏（解放军总医院第五医学中心），姬峻芳（浙江大学生命科学院）
引证本文：欧美同学会医师协会肝胆分会, 中国研究型医院学会分子诊断专委会, 中国临床肿瘤学会肝癌专委会, 等. 肝胆肿瘤分子诊断临床应用专家共识［J］. 临床肝胆病杂志, 2020, 36(7): 1482-1488.
◆中国体外诊断产品209项行业标准汇总◆1427家体外诊断生产及服务企业名录◆393种免于进行临床试验的体外诊断试剂
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