三小组未能重现韩春雨论文结果，《自然-生物技术》称1月公布调查进展

原创 2016-11-29 Calo 果壳科学人

11月29日，《自然-生物技术》发表题为《利用Natronobacterium gregoryi Argonaute (NgAgo) 未能检测到DNA引导的基因组编辑》的通讯文章[1]，称三个实验组独立对韩春雨今年五月初发表的论文结果[2]进行了重复实验，但都无法重现韩春雨在原论文中宣称的结果。期刊还同时发布一份声明，称会对批评进行审慎和全面的评估，同时也给韩春雨等原论文作者提供机会展开调查，并在2017年1月底之前完成其调查。

来自三个研究组的阴性结果

今年5月，河北科技大学韩春雨等人在《自然-生物技术》期刊上发表论文，称基于5'端磷酸化的gDNA序列和NgAgo蛋白的基因组编辑系统能在哺乳动物细胞系中对基因组进行编辑。

根据这篇论文提供的信息，来自德国弗萊堡大学的托尼·卡索曼（Toni Cathomen）研究组、美国梅奥医院的斯蒂芬·埃克尔（Stephen C. Ekker）研究组以及韩国首尔大学的金镇秀（Jin-Soo Kim，音译）研究组各自合成了同样的5'端磷酸化的gDNA序列，同样使用韩春雨提供给Addgene信息库的NgAgo载体，并且将其转染到同样的人类细胞系中。在对照实验已证实5'磷酸化的gDNA及NgAgo质粒被有效转入细胞，NgAgo蛋白也已获得表达的情况下，这三个研究组进行了多项实验，但无一成功检测到对目标基因组序列的编辑。

三个研究组的实验结果以通讯文章形式发表在了《自然-生物技术》期刊上。这也是韩春雨NgAgo论文所在的期刊。图片来源：Nature Biotechnology

卡索曼的研究组在HeLa和HEK293T两种细胞（在韩春雨论文中均有使用）中通过质粒表达绿色荧光蛋白，再试图按照韩春雨在其论文中提供的实验设置，利用NgAgo系统对编码绿色荧光蛋白的基因进行编辑，但绿色荧光蛋白的表达并没有因此呈现任何统计学上显著的减少。但利用SpCas9系统进行编辑，则让相同细胞系中的绿色荧光蛋白表达显著降低。

埃克尔的研究组使用了韩春雨在其论文中用到的5条gDNA序列及NgAgo载体，在三种人类细胞系（在韩春雨论文中均有使用）中进行实验，试图对基因组中的DYRK1A基因（即韩春雨在论文中设定的编辑目标）实施编辑。他们的45次实验均以未能检测到的DNA序列变化而告终（检测阈值为2%），而韩春雨的原论文称编辑效率大于20%。“假设NgAgo引起（DNA的）插入/缺失的真实普遍性为0.20，并满足正态分布，我们的零假设是‘NgAgo不能在人类细胞中以大于等于0.20的比率引起插入/缺失’。在对45个独立样本进行测试后，我们观察不到任何插入/缺失证据的可能性是p = 0.8^45 = 4.4 × 10^(–5)。”他们在通讯文章中写道。

埃克尔的研究结果提示，NgAgo和gDNA并不能在目标基因序列中引起插入/缺失，尽管他们选取的NgAgo载体、细胞系、目标基因序列、gDNA序列等都与韩春雨在论文中使用的一致。图片来源：参考文献[1]

金镇秀的研究组利用NgAgo系统，在HeLa和HEK293T两种细胞中进行了实验，试图编辑韩春雨在论文中称成功编辑的四个人类基因位点（DYRK1A, EMX1, GATA4, GRIN2B）。但最终，无论是通过T7E1酶切法还是通过深度测序检查，都没能检测到NgAgo系统在上述四个位点引起的任何编辑。作为对照，利用SpCas9系统则能对相应位点引入不同程度的插入/缺失。

在包括上述实验在内的种种尝试中，卡索曼、埃克尔和金镇秀研究组获得的结果都指向一个结论：只通过共导入NgAgo质粒和5'端磷酸化的单链gDNA，并不足以按韩春雨原论文中所称的频率引起基因编辑。

《自然-生物技术》
发表“编辑部关注”及声明

在发表上述通信文章的同时，《自然-生物技术》也刊登了一则“编辑部关注”[3]。中文译文全文如下：

编辑部关注：利用NgAgo进行DNA引导的基因组编辑

《自然-生物技术》的编辑就上述论文发表“编辑部关注”，以提醒读者人们对原论文结果的可重复性存有担忧。此次，我们发表三个团队的实验结果（http://dx.doi.org/10.1038/nbt.3753），他们都设法去重复韩春雨及同事发表在原论文中图4的结果，这一关键图表展示了对哺乳动物细胞内源性基因位点的编辑。这些团队无一能在任何位点，或在任何高于检测方法敏感度的条件下观察到NgAgo所诱发的变异。另外一组作者在《蛋白质与细胞》期刊也报告了类似结果（doi:10.1007/s13238-016-0343-9）。

我们和论文作者进行了沟通，他们正在调查造成可重复性缺乏的潜在原因。我们向其告知了这一声明。尽管调查仍在进行中，但韩春雨和沈啸同意我们发表的这一编辑部关注，高峰、姜峰和武永强则认为目前并不合适。这些调查一旦完成，我们会向读者提供最新信息。

11月16日，《蛋白质与细胞》（Protein & Cell）期刊在线发表了一封读者来信[4]，作者为包括北京大学魏文胜研究员在内的20位科学家。他们在信中反映，各自所在的研究组均无法重现韩春雨在NgAgo论文中述及的结果，呼吁“原始论文的作者澄清NgAgo的不确定性，并为重复出最初那些重要的结果提供所有必要的细节”。11月11日，南通大学刘东团队也曾在《细胞研究》上发表致编辑信[5]，结果显示NgAgo系统无法用于编辑斑马鱼基因组。

加上今天发表在《自然·生物技术》上的通讯文章，发表在国际学术期刊上、表明NgAgo系统未能进行基因组编辑的文章已经有三篇。有鉴于此，《自然-生物技术》发表了一则最新声明[6]：

关于韩春雨及同事发表于《自然-生物技术》的“DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute”（利用NgAgo进行DNA引导的基因组编辑）一文的声明

《自然-生物技术》今天就此前发表的韩春雨及同事所著论文“利用NgAgo进行DNA引导的基因组编辑”发表了“编辑部关注”，并发表Toni Cathomen及同事的通信文章，题为 “利用Natronobacterium gregoryi Argonaute (NgAgo) 未能检测到DNA引导的基因组编辑”。

《自然-生物技术》已审慎考虑过所有关于韩春雨及同事原著论文的评论。在任何情况下，如果一篇论文在发表后遭到批评，我们都会对各种批评进行审慎和全面的评估，此次也不例外。今天，我们不仅发表了Cathomen及同事的通讯文章，这可能会否定原论文所称的有效编辑内源性基因的这一主要发现；而且我们还连同该通讯文章一起发表了“编辑部关注”，以确保读者知晓Cathomen及同事的论文，以及另外一篇在别处发表的论文(doi:10.1007/s13238-016-0343-9)所提出的担忧。目前，原论文的作者中有两位，即韩春雨和沈啸，同意我们发表的“编辑部关注”，而高峰、姜峰和吴永强则认为这并不合适。

《自然-生物技术》认为，让原作者在能力所及的情况下对上述通信文章所提出的担忧展开调查，并补充信息和证据来给原论文提供依据是非常重要的。因此，我们将继续与原论文的作者保持联系，并为他们提供机会，以在2017年1月底之前完成其调查。届时，我们会向公众公布最新进展。

（编辑：wuou）

参考文献：

1.Seung Hwan Lee, et al. "Failure to detect DNA-guided genome editing using Natronobacterium gregoryi Argonaute". Nature Biotechnology (2016).

2.Gao, Feng, et al. "DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute." Nature biotechnology (2016).

3."Editorial Expression of Concern: DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute." Nature biotechnology (2016).

4.Burgess, Shawn, et al. "Questions about NgAgo." Protein & Cell (2016): 1-3.

5.Qi, Jialing, et al. "NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish." Cell Research (2016).

6."Statement regarding 'DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute' by Han Chunyu and colleagues, published in Nature Biotechnology" Nature biotechnology (2016).