细胞凋亡检测指标及凋亡分析的总体原则（周三、05-04）
昨天的一期我们给大家简单的介绍了细胞凋亡的定义、早中晚期所发生的主要事件以及经典的两条细胞凋亡途径。今天我们给大家带来的是细胞凋亡过程中我们有哪些指标的检测。 细胞凋亡比较早期时，细胞膜即出现了一些改变，细胞膜磷脂双分子层中的磷脂酰丝氨酸从细胞膜内翻转到细胞膜外，暴露于细胞膜；Annexin V 是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，在Ca2+存在的情况下，与磷脂酰丝氨酸有很高的亲和力，因此Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。当AnnexinV 被荧光素标记时，可在流式细胞仪上或荧光显微镜下检测到早期凋亡的细胞。同时，也可以利用PS外翻到胞外，利用其PS抗体进行检测。 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，通常以无活性的原酶形式存在于细胞中。其中Caspase 2、8、9及10作为起始Caspases，Caspase 3、6、7作为执行Caspases。在细胞凋亡中期，效应的caspases会被激活，可以通过检测凋亡细胞的caspases活性及筛选caspases的激活剂或抑制剂，达到检测caspases活性的目的。其检测可以利用免疫捕获法、抑制剂结合法及抗体WB检测法。关于筛选凋亡的指标进行WB检测法，Arigo提供了细胞凋亡指标的抗体对，相同的价格可以购买两支抗体。如Apoptosis Marker Antibody Duo (Caspase3, PARP)及Mitochondria Apoptosis Initiator Antibody Duo (APAF1, Cytochrome c)。 细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3‘-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为TUNEL法。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。 DNA的片段化检测：组成染色质的DNA链被激活的核酸内切酶切割，可形成180-200bp或其整倍数的片段化，电泳中呈特征性的“梯”状条带，这是判断凋亡发生的客观指标之一。 线粒体膜电位检测：使用一种阳离子染料（JC-1），该染料在正常细胞内聚集在线粒体内，形成多聚体，发鲜红色荧光；而在凋亡细胞内，由于线粒体膜电位的破坏，不能进入线粒体内，以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光。因此，根据红绿荧光可以方便地区分正常和凋亡细胞。利用荧光显微镜，激光共聚焦显微镜或流式细胞仪可清楚地分辨这两种不同的荧光信号。 细胞色素C的检测：细胞色素C（cytochrome c ）位于线粒体内膜和外膜之间，在外界凋亡刺激物的作用下，可以从线粒体释放到胞质内，并与胞质中的Apaf-1结合。细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9，即而激活caspase-3及其下游的caspases，启动凋亡过程。从细胞质中分离富线粒体的组分，然后用试剂盒的细胞色素c 抗体，通过Fluorescent、Western Blot方法检测细胞色素c 从线粒体到细胞质的释放。 谷胱甘肽（GSH）检测：许多细胞发生凋亡时，细胞浆内的谷光苷肽（GSH）水平会降低，此现象发生在细胞凋亡非常早的阶段，因此检测谷胱甘肽的水平可以早期判断和检测凋亡。 NO( 一氧化氮) 检测：NO 参与细胞凋亡的调节，凋亡细胞中NO 的合成速度远高于正常细胞，因此检测凋亡细胞中的NO水平有助于更好的了解NO对细胞凋亡的调控机制。 NO 均被氧化为亚硝酸盐(NO2-)和亚硝酸盐(NO3-)，用这些阴离子的浓度可用来定量所产生的NO的浓度。 Bcl-2家族活性检测 组蛋白H2A.X和H2B：凋亡发生时会发生染色质DNA的浓集，浓集的DNA可以被caspase相关的DNA酶断裂，同时组蛋白H2B的14位丝氧酸发生磷酸化修饰。组蛋白H2B的14位丝氨酸发生磷酸化修饰是凋亡不可逆进展的重要标志 端粒酶活性检测试剂盒 因为凋亡是多因素、多通路参与的过程，不能根据单一指标来判断调亡；所以需进行多指标同时检测。 由于凋亡细胞不同时间出现的凋亡事件不同；而每个指征维持有一段，所以需要在不同的时间点进行采样，以保证检测结果的准确性。 实验需要设定阳性和阴性对照，避免出现假阳性或者假阴性 根据实验对象（材料）的具体情况、设备配套等选择可行的方案 关于细胞凋亡的实验手册，如有需要请留言。留下您的称呼、单位及联系方式即可。