ELISA实验的童鞋们，看这里（周二、05.24）
细胞之邦，互助你我。感谢大家的关注，我是小邦。前期我们介绍了WB、IHC实验中常见问题分析，今天我们给大家介绍的是ELISA实验中常见问题分析。 结合反应太强或时间过长：检查底物的稀释，使用建议的稀释度。当酶标板显色足够进行吸光度读取时立即用终止液终止反应 底物溶液或终止液不是新配制：使用新配制的底物溶液。终止液应该是清亮的（如果它变黄，这是被污染的标志，需要重新配制） 没有终止反应：如果底物反应没有被终止，颜色会继续变化 酶标板在酶标仪读板前放置时间过长：颜色会继续变化（尽管加了终止液，依然会以很慢的速度变化) 底物孵育过程没有避光：底物孵育应该在避光条件下进行 抗体非特异性结合：确保进行了封闭并使用的是恰当的封闭液。我们建议使用5-10%的与二抗同种动物来源的血清或牛血清。确保板孔经过预处理以防止非特异结合。使用亲和力强、纯度高的抗体，最好经过了预吸收。 使用的样品中没有显示出靶蛋白或者靶蛋白显示的水平低：检查靶蛋白表达系统，确保它在您的样品中被表达出来。如果靶蛋白的表达水平低，需要增加样品使用量，或者您可能需要选择一个更灵敏的测定方法。确保您使用的是没有超出测定方法检测范围的阳性对照 抗体不足：确定使用的是建议的抗体量，为了使结果更好可能需要增加抗体的浓度 底物溶液不是新鲜配制：使用前新鲜配制底物溶液 孵育时间不够长：如果建议了孵育时间，确保按推荐的时间长度孵育抗体。为了使结果更理想，孵育时间可能需要增加 吸液不一致：确保移液器使用正确并经过校准、确保枪头插得足够紧密。板子稀释时要特别仔细，注意确保每个枪头都吸上和排出正确量的液体，这对平行样品结果的一致性有很大影响。 抗体稀释液/试剂未混匀：为保证板子所有孔的浓度一致，确保所有的试剂和样品在加到板子上以前都被混合均匀 板孔变干涸：确保所有孵育期间酶标板始终被盖好。放置一个潮湿的水盘(保持清洁，无菌水)在孵育箱的底部 洗板不充分：这将导致一些孔没有其他孔清洗的好，残留不同量的未结合的抗体，使后面的结果产生不一致 酶标板底部不净影响吸光度读取：读板前小心清洁酶标板底部 阴性对照出现阳性结果 夹心ELISA - 检测抗体与包被抗体反应：确定使用的是正确的包被抗体和检测抗体,他们之间不会互相反应 酶标板洗板不彻底：用洗液充满板孔确保每孔被充分洗涤，洗板前确保所有的剩余抗体溶液被倒净 抗体量过多导致非特异结合：根据推荐的用量使用合适浓度的抗体 试剂/样品污染：试剂和样品可能被污染，或者由于孔之间的溅洒交叉污染。使用新鲜试剂，小心操作移液器 欢迎高手分享经验 欢迎新手提出问题