免疫组化瓶颈了吗？台湾arigo抗体专家温博士为您现场解答
细胞之邦，互助你我。感谢大家的关注，我是小邦。今天我们给大家带来的是免疫组化的实验步骤剖析。
标本固定：固定的目的是①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存。固定剂的选择一般用 4%多聚甲醛。
脱水、石蜡包埋和制片：脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。否则，容易裂片和脱片等。
脱蜡和水化：这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。脱蜡可以先 60 度 20min，但当天制好的切片一般先 60 度 3-4h。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脱蜡和水化不全易产生非特异性背景着色。
抗原修复：由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种（具体的可以查阅相关资料，大量的：中性的、高pH 的等）。
细胞通透：目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用 Triton X-100、蛋白酶 k 等通透液。如 Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
灭活内源性过氧化物酶和生物素：在传统的 ABC 法和 SP 法中，免疫组化反应结果容易受到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活
血清封闭：组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；一般室温 10- 30min。但也要防止封闭过度
一抗和二抗浓度和孵育时间：一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间、温度和抗体浓度。一抗孵育温度有几种： 4 度、室温、37 度，其中 4 度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般 37 度 1-2h，4 度过夜（从冰箱拿出后 37 度复温 45min） 。具体条件还要摸索。二抗孵育条件：二抗一般室温或 37 度 30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度。
抗体稀释液：其实许多实验室抗体稀释液就用一般 PBS 即可，但专用的抗体稀释液中除 PBS 成份外，还加了叠氮化钠防腐剂、BSA 稳定剂等组份，对抗体的多次回收利用较好
切片清洗（浸洗、冲洗和漂洗）：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，注意：①单独冲洗，防止交叉反应造成污染。②温柔冲洗，防止切片的脱落，一般用浸洗方式；③冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。④PBS 的 PH 和离子强度的使用和要求（建议 PH 7.4- 7.6，浓度是 0.01M； 中性及弱碱性条件有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）
DAB 显色：背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由 DAB 孵育条件决定。 DAB 显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗
复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用苏木素复染（胞核染料）
封片： 为了长期保存，我们一般用中性树胶等封片，避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡