WeChat ID bbs-abbiomall Intro 细胞之邦——剖析细胞、分子、免疫学实验及分享实验培训、讲座、科研工具的平台 电泳准备？ 玻璃配胶板要清洗干净，以免引起配胶问题，影响蛋白分离 配胶液要充分混匀，凝聚时间要够，如胶凝聚不均匀，会造成胶分辨率差。出现笑脸皱眉条带 电泳时，上样体积和浓度最好保持一致，这样可以防止出现条带过宽或者过窄的情况产生 如何选择膜？ 膜上有蛋白质的结合位点，可结合从凝胶中转移的蛋白质。常用的膜是硝酸纤维素膜（NC膜）和PVDF膜。 NC膜 低分子量蛋白检测 通常用于化学发光法 蛋白剥离效果不理想 PVDF膜 低表达蛋白结合能力强 通常用于荧光方法（自发荧光背景低） 剥离和二次杂交时，蛋白的截留能力强 如何建立转膜系统 常用的转膜系统形式为 “三明治” 结构，凝胶和膜紧密贴合，放在两张转印滤纸之间，用电极板夹夹住，置于转印buffer中，正负电极通电后，将蛋白质从凝胶转移到膜上。转印滤纸 （滤纸） 能够保持均匀一致的压力，确保膜和凝胶间没有空隙，并保持转移buffer充盈在“三明治”结构中蛋白完全从凝胶转移至膜上。  Blot前准备什么？ 当优化转印设置、条件及实验时，最重要的是确定样品中所有蛋白是否从胶上完全转移到膜上。 膜封闭 封闭目的是防止非特异性结合，降低背景对目的信号的干扰。如使用脱脂奶粉做封闭液，最好将脱脂奶粉进行滤膜过滤，这样可以减少后期颗粒背景的产生。 一抗孵育 确保新的一抗浓度经过优化。如有确证过的一抗，可尝试将一抗标记荧光染料，直接进行一步法Western blot检测。 洗膜和二抗孵育 每次孵育后，洗去多余的抗体对于降低背景信号至关重要。荧光方法Western blot中，洗膜还可以去除有自发荧光的去垢剂。洗膜的时候如果多张，建议分开进行清洗，同时洗膜液体积不能太少。 化学发光检测 尝试不同的底物增加灵敏度和信号持久性；化学发光底物使用前需要平衡至室温，可以增加酶的活性；数字成像系统要灵敏度很高。 荧光检测 保持所有物品的清洁，确保无背景干扰；印迹膜避光保存；使用背景淬灭板降低背景荧光，增强信噪比。 转至：Azure蛋白印象 1、电子书籍分享--免疫学技术及其应用_曹雪涛2010 2、周末书籍分享--Animal Cell Culture哺乳动物细胞培养 3、书籍分享--Human Embryonic Stem Cell Protocols-Humana Press (2016) 4、电子书籍分享--Cancer Medicine (8th）edition) 5、细胞实验技术大集合 6、你的细胞快乐吗？（5.12周四） 7、细胞培养那些事儿 诚聘兼职编辑：只要您认为自己的思维足够有逻辑、对研读最新Paper感兴趣，欢迎加入我们。 有意向者，请发邮件至marketing@abbiomall.com。经过审核后，我们会第一时间与您联系并沟通稿酬。（邮件需附上个人简历） 微信咨询：abbiomall02 细胞之邦——剖析细胞、分子、免疫学实验 及分享实验培训、讲座、科研工具的平台  Author requires users to follow Official Account before leaving a comment Write a comment Write a comment Loading Most upvoted comments above Learn about writing a valuable comment Scan QR Code via WeChat to follow Official Account