完整版细胞生物学研究方法与技术
1、举例说明你认为有哪些方法可鉴别细胞发生凋亡而不是坏死？
A、台盼蓝染色鉴定：坏死细胞胞膜破裂，染料能进入细胞，使细胞染成蓝色；正常细胞或者凋亡细胞胞膜完整，对台盼蓝拒染。这一方法结合电镜观察更加准确，电镜下可见凋亡细胞表面纤毛丧失，细胞核沿核膜内侧边缘开始固缩，电子密度升高等。
B、Hoechst33342、PI染色，荧光显微镜观察：两者均为仅与细胞核DNA结合的染料，荧光镜下可鉴别凋亡与死亡细胞的核变化。利用Hoechst33342-PI染色法，正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅；凋亡细胞主要摄取Hoecha染料，呈现强蓝色荧光；而坏死细胞主要摄取碘化丙啶（PI）而呈强的红色荧光。
C、丫啶橙（AO）染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。坏死细胞不出现凋亡小体。
D、DNA凝胶电泳检测其片段化：凋亡细胞染色体在核酸内切酶的作用下出现核小体间有规律断裂，断裂的DNA片段约为180bp或其整数倍，这是凋亡细胞最重要的生化特征。凋亡细胞DNA凝胶电泳能观察到DNA片段组成的梯形条带，而坏死细胞DNA由于被溶酶体中DNA酶切割成连续大小的片段，在DNA凝胶上呈现为弥散模糊的条带。
E、流式细胞学检测：凋亡细胞通过DNA荧光染色，有如下流式细胞学特征：DNA特异性荧光减少，细胞浆膜完整，线粒体仍有跨膜电位，蛋白含量明显减少等。根据以上特征，Huschtscha等用碘化丙啶染色及细胞光散射的特点提出了检测凋亡细胞并与坏死细胞相区别的方法。在DNA直方图上，凋亡细胞出现二倍体峰的减少，二倍体峰左侧出现亚二倍体细胞群的峰型。而坏死时，细胞周期中的细胞均出现不同程度的减少，亚二倍体细胞量多少不等。在光散射图上，凋亡细胞出现低于正常的前向散射和较高的侧散射，坏死时则呈现单一的前、侧高散射。
2、试比较腺病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体的主要优缺点。
病毒载体类型 | 优点 | 缺点 |
腺病毒载体 | 在大多数组织中有相当高效的转导作用 | 衣壳会介导很强的炎症反应 |
逆转录病毒载体 | 在分裂的细胞中具有持久的基因转移作用 | 仅在分裂细胞中进行转导；在一些情况下进行融合会诱导肿瘤的产生 |
慢病毒载体 | 在大多数组织中具有持久的基因转移作用 | 在一些情况下进行融合会诱导肿瘤的产生 |
3、软琼脂集落生成的技术路线及实验意义。
一、实验技术路线：
1琼脂制备：用双蒸水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖溶液，高压灭菌后，维持在40℃中勿令凝固。
2制备出2xDMEM（含2x抗生素和20%牛血清），过滤除菌后，保存于37℃备用。
3底层琼脂制备：按1：1混合1.2%的琼脂糖和2xDMEM后，取3ml混合液注入直径6cm平皿中，待冷却凝固，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中备用。
4单细胞悬液制备：用细胞培养液制成单细胞悬液，计算细胞活率并计数后备用。
5上层琼脂制备：按1：1比例将0.7%琼脂和2xDMEM在无菌试管中混匀,总体积为3ml，再向管中加入约1000个细胞的细胞悬液,充分混匀、注入已铺有底层琼脂的平皿中，形成双琼脂层。
6待上层琼脂凝固后，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养10-14天。
7观察细胞集落。
8集落计数方法：
（1） 倒置显微镜下观察、拍照并计数集落数。
（2）一般以直径>60um的细胞集落为一个克隆，但根据细胞类型不同而略有差异。
（3） 统计学方法分析组间差异。
二、实验意义：
软琼脂集落生成实验是目前检测转化细胞和肿瘤细胞最为常用的方法，也是与细胞恶性程度最相符合的方法。是体内成瘤实验的体外实验模型,对是否具有体内成瘤性具有重要的提示作用。
4、简述杂交瘤方法制备单克隆抗体过程中HAT选择培养的原理。
单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。 细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。
5、简述单细胞凝胶电泳实验的实验原理及其应用。
一、实验原理：
将单个细胞悬浮于琼脂糖凝胶中，经裂解处理后，再在电场中进行短时间的电泳，并用荧光染料染色，受损细胞中形成的DNA片段在电场中泳动速度较快，使细胞核呈现出一种彗星式的图案，而正常的无DNA断裂的核在泳动时保持圆球形。
有核细胞的DNA超螺旋结构附着在核基质中，用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液的作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜遭到破坏，使细胞内的RNA、蛋白质及其它成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，但核DNA仍保持缠绕的环区附着在剩余的核骨架上，并留在原位。如果细胞未受损伤，电泳时，核DNA因其分子量大停留在核基质中，荧光染色后呈现圆形的荧光团，无脱尾现象。若细胞受损，在碱性电泳液（pH>13）中，先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小可进入凝胶中，电泳时断链或碎片离开核DNA向阳极迁移，形成拖尾。细胞核DNA 受损伤越严重，产生的断链或碱变性断片就越多，片段也越小，电泳表现为尾长增加和尾部荧光增强。因此，通过测定DNA 迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定单个细胞损伤的程度。彗星试验检测单细胞水平DNA 损伤，无需放射性示踪，适用于各种有核细胞，样品用量少，试验周期短，灵敏、快速、简便。
二、实验应用：
（1）在检测诱变剂、射线等对DNA的损伤、监测环境污染物对机体的遗传损害、研究毒物致癌机制等方面有广泛的应用价值。
（2）现被应用于遗传毒理、放射生物学、生物监测、癌症化疗和细胞凋亡、衰老等领域，尤其应用于新药开发、保健品开发、化妆品开发、环境监测和毒理学研究等领域。
（3）进行凋亡细胞的检测。
6、简述免疫组化技术方法的原理及优点。 举例说明在免疫组化实验中如何设置对照系统？
一、原理：免疫细胞化学又称为免疫组化，是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体（或抗原）的显色剂 (荧光素、酶、生物素、金属离子等) 显色来确定细胞或组织内相应抗原（或抗体）的成分，对其进行定位、定性及定量的研究。
二、优点：
1.高度的特异性。抗原抗体反应是特异性最强的反应之一，免疫细胞化学所用的抗体必须是特异性强的多价或单价抗体，具有高度的认别能力，在抗原识别上可达到单个氨基酸的水平，这是其它组织化学方法难以相比的。
2. 敏感性高,现代免疫细胞化学采用各种有效方法最大限度保存细胞和组织内待检物质的抗原性；使用高度敏感的和高亲和力的抗体，保证可检出细胞内超微量的抗原分子，用显微镜和电子显微镜观察结果，因此，它是在细胞、分子水平或基因水平的检测技术。
三、 如何设置对照系统：
（一）、直接免疫荧光法设置对照：
自发荧光对照(空白对照)：加PBS代替一抗。
同型对照：免疫前血清的抗体
阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特 异性抗体(可省略)。
已知的细胞对照。
（二）、间接免疫荧光法设置对照：
空白对照：用PBS代替一抗
同型对照
阳性对照
已知细胞的对照
7、简述DNA损伤与修复研究方法的原理并举出2种研究方法。
一、修复方法及原理
1、光复活：由光复活酶催化，直接利用300-600nm波长的光量子能量来完成。其基本过程是：先是每个光复活酶分子与一个嘧啶二聚体相结合而形成复合体（这一步不需要光）。复合体吸收300-600nm的光，是嘧啶二聚体中的两个交联共价键裂开，复原为两个正常的嘧啶单体，此步反应叫单体化作用。接着光复活酶从DNA上脱离，DNA分子恢复原样。光复活作用不涉及磷酸酯键的切开，没有发生新的合成，也无其他副产物，属于无错修复。
2、碱基切除修复：在细菌和真核细胞中发现多种DNA糖苷酶，它们能识别和切除某些错误的或损伤的碱基。绝大多数DNA糖苷酶，对其所能识别的切除的碱基对象有高度的专一性。切除时的作用原理，是将碱基与脱氧核糖之间的糖苷键水解断裂，释放出游离的碱基，从而在DNA链上造成一个无嘌呤或无嘧啶的AP位点，主链并不切断。
二、研究方法：
1、放射自显影：在细胞培养物中加入氚标记的胸腺嘧啶核苷等放射源,用放射自显影方法计数银颗粒数来测定修复合成过程中参入到DNA分子中的量。
2、超速离心法：一种应用比较广泛的方法，可应用于切除修复、复制后修复及链断裂修复方式的检测。一般是用氚标记溴脱氧尿嘧啶核苷等参入到修复合成的DNA分子中去以改变DNA分子的重量(BrdU的分子量比尿嘧啶核苷大),通过超速离心可以从沉降系数不同的各组分中收集修复合成中参入量不同的DNA片断,然后分别测定其放射性的强度来判断修复合成的多少。
8、如果要用Western blot检测培养细胞上某种蛋白的磷酸化改变，如何配置缓冲液和进行实验操作？叙述关键步骤和配方的基本原理。
检测磷酸化时必须加磷酸酶抑制剂，缓冲液须高钾/高镁/高锰，低钠/低钙。
实验过程中必须在同一次Western blot中区分某蛋白磷酸化与否。
1、选择可将磷酸化与否分成不同区带的电泳条件；
2、用一种对磷酸化与否均可显色的蛋白进行免疫印迹；
3、Photoshop计算扣除本底后的累计密度比值；
4、电泳区带定量
原理：蛋白子发生磷酸化，其分子量可能发生变化，从而：
某些蛋白或位点磷酸化：区带上移: CDK1(cdc2);
某些蛋白或位点磷酸化：区带变化不大；
某些蛋白或位点磷酸化：区带下移: CDK2
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