OMG,实验室的科研牛人不会告诉您的这些事!（1.20周三）
大家好，我是小邦，看了微论坛之后，是否有所得呢？欢迎在底部的留言区进行留言噢！今天给大家推送的是细胞之邦论坛微信公众号的第51期微论坛噢！ 喜欢的话，可以转发分享给您的小伙伴们噢！
最近雨天多，又冷，小伙伴们记得带伞和添衣保暖噢！
贴心小提示：微论坛受到科研君们的喜欢和支持！我们将会一如既往地给小伙伴们提供更好的实验技术解决方案专题，帮忙为小伙伴们解答疑惑，喜欢的亲，可以转载到朋友圈，也可以自己收藏学习噢！欢迎提出意见和建议噢！ |
经常看到一些刚进实验室的同学们为实验的启动而头疼，无人或者少人带着自己做实验，该咋办呢？我们今天准备了蛋白电泳这一块实验相关的知识，可是实验室里的牛人不会告诉您的那些事噢！
做蛋白电泳时，经验发现，8%胶最底边约36KDa，10%最底边约25KDa，12%最底部约12KDa。8%胶可以跑300KDa-36KDa之间的任意蛋白，转膜效率对WB结果的影响不大。
电泳一般采用恒流，应根据电泳仪器适当调整，要注意仪器最高限压。采用恒流的优点，保证最快速度完成电泳（电压会逐渐增大），省时且减少扩散；但是由于电泳速度过快时会发热而溶胶，所以必须想办法散热。散热不好，条带会出现波浪状。
1．聚丙烯酰胺的30%母液会降解，要4度避光保存。
2．APS会失效，10%APS一般保质期才一个月左右。因此于-20度分装长期保存。
3．注意Tris buff的PH值，以及平时所用的水的PH值。PH值改变会使带型非常怪异，所有蛋白和溴酚蓝压成一条细线（即便在分离胶中），如果溴酚蓝前有红色染料，那么此染料彗星式拖尾从溴酚蓝一直延伸到胶底部（溴酚蓝此时涌动极缓慢，位于胶中上部）。
4．若上下层式电泳装置漏液，电泳条带就往漏液方向倾斜。若内外式电泳装置漏液，则装置处于短路状态，液体会过热。而SDS-PAGE胶可能局部自溶，条带扭曲、变形。
5．配胶用的玻璃板和边条应及时洗净。玻板未洗净的坏处有很多。尽管玻璃看似平滑，但是一些细微的凹陷处会凝结肉眼无法分辨的胶颗粒（摸上去疙疙瘩瘩），其坏处是，在该部位极易导致不均匀的胶块，样品经过该处或电泳散热不好，条带变形。如果是RNA的超薄胶，胶板的颗粒会导致局部巨大气泡，非常难于清除；蛋白胶也会导致一些小气泡的产生。玻板没洗净的另一个坏处是，由中学物理知识可知，玻璃表面越光滑粘附越牢，未洗净的玻板会削弱和胶体间的粘附力，拔梳子或边条时会产生微小的错动，胶体下部出现大量气泡（夹在玻板和胶之间，这个关系不大）；严重的错动会在上样时，样品从胶和玻璃之间的间隙漏光，甚至胶和玻板分开。为避免拔梳子时的错动，可在电泳缓冲液中拔梳子（比水更好，有SDS润滑）。
判断玻板是否洗干净，用手摸一下有没有疙疙瘩瘩的；最好用洗洁精之类，洗衣粉、肥皂都不好用。
6．上样时，不要把tip深入胶孔过深（或者采用细的尖端拉长的专用上样枪头），可能会错开胶和玻板，样品会泄露。
7．未加样的孔应添加高浓度SDS LB平衡，否则最外侧条带会拉宽变形。通常20ul样品（含5ul 4*SDS LB），可用8-8.5ul4*SDSLB平衡。同理，点marker的lane也要加入同样体积的LB。LB若在室温放置太久和新鲜的会在比重上有差异，在新旧LB靠近的地方，条带会拉宽或挤压变形。因此，同一块胶上，煮样及填空白所用LB应一致。LB应-20度保存。
8．增加上样量不一定会提高荧光信号强度。增加上样量的后果通常只能是让内参粘连，所有的蛋白条带都扭曲变形。因为增加上样量最多只能提高几倍，而WB灵敏度是以10的几次幂量级的，所有目的蛋白信号的唯一方案就是IP富集（可特异提高目的蛋白浓度数百数千倍，并去除其它杂蛋白干扰）。增加上样量的另一个坏处是，本来高表达的蛋白，诸如内参，在同样WB条件下，可能出现荧光灼烧式粹灭（一晃而灭）或者条带中空。
仍以6孔板80%以上汇合度为例，细胞裂解液和SDS LB通常都是投入200ul（最少80ul，这样面积的培养板如果裂解液投入太少，回收时的损失就太大，上样就很难做到一致），而这种浓度条件下制备的样品，电泳时上样量要控制在5-6ul，最少2.5ul，最多10ul，10ul时内参基本已经开始粘连成一条线，带型出现波浪纹；当然并非不可以多上样，再多对WB结果影响不大（没有的仍然没有），且条带都很丑。
9.不同样品上样时，可考虑将样品体积调成一致或类似。如果一组IP样品和一组细胞裂解液样品，前者通常洗脱体积为15ul，刚好+5ul 4*SDS LB达到常规20ul上样体积；后者在第8点中提到只上5ul，同样+5ul SDS LB（比重相同，不会互相挤压），最好补加10ul DDW使总体积一致。通常这样不同条件获得的样品，中间最好用“空白”泳道隔开（空白仅指无蛋白，仍应加入8-8.5ul 4*SDS LB），这样才能确保每条带都很美观。
10. SDS-PAGE胶配好暂不用时，需用电泳缓冲液灌满空间（拔去梳子和底边边条后的间隙），用保鲜膜包裹防止液体蒸发，短期室温或稍长期4度保存。而如果预计次日工作量较大，可以提前灌好SDS-PAGE。
如果你看完了本期微论坛后有什么心得和想法，可以在底部评论区畅所欲言哦~
❤❤小贴士：
1、评论区期待看到大家的睿智分析、辛辣点评、欢乐交流、经验分享与反馈。
2、我们会精选优秀评论予以显示，目前的中选率高达40%，把握机会哦！
3、目前评论区的微信头像和昵称是实名显示，涉及隐私信息请自行权衡呦~