市场上循环肿瘤细胞（CTC）检测产品的概况（中）
市场上循环肿瘤细胞（CTC）检测产品的概况（中）
继续讲解CTC的一个概况，本篇内容主要介绍CTC的的检测技术手段。
CTC首先是一种生物标志物（biomarker），这是目前研发与应用的重点，被寄希望用于癌症预后、分期、疗效监控、复发预测、用药指导、早期检测等等的标志物，下面一张图是美国最好的癌症医院之一的医院临床医生对CTC的期望。评价临床价值的高低主要看病人获益的大小。
但是目前主要用CTC的数目作为标志物这个信息量显然太小了。CTC作为一个完整的细胞，包含了完全的生物学信息，从基因到蛋白到功能等等一系列的信息。CTC还可以培养，用于筛选药物。只要尽可能多的获取CTC各个层面的信息，才有可能从中找到真正好的标志物。
其次，CTC不仅仅是一个标志物，同时也可能是药物的靶点，这也是它跟ctDNA的区别之一。作为药物靶点价值不可估量！如果能有效消灭CTC是否能够控制并减少癌症转移，毕竟90%以上的的癌症患者都是死于转移。（Billion $ question!）。
CTC技术主要谈五个方面：
1) 发现-分离/捕获 （找到它、抓到他）
2) 鉴定 （是不是“红军”-CTC，拷问它）
3) 诊断 （与临床挂钩，与其它信息验证，“审判”
4) 治疗 （疗效检测、用药或治疗指导）
5) 新药开发 （伴随诊断，endpoint 可替代的药效终点）
发现-分离/捕获很多人都能做，全球40多种产品/技术，但谁都说自己做的“最”好！看下图 ：
a) 生物学特性-蛋白表达
i. 正向富集（抗体结合CTC），又分为- 体外分离（抽血），体内捕获（不抽血，抽CTC）
ii. 负向富集 （抗体结合白细胞等非CTC）
b) 物理特性- 大小、电荷
i. 膜过滤、芯片过滤、梯度离心
ii. DEP：介电泳，也称双向电泳,介电力大小与物体是否带电无关，与物体的大小、电学性质、周围介质的电学性质，以及外加电场的场强、场强变化率、频率有关，DEP的优点是易与流体系统结合、不须标定、对少见的细胞有高选择性。介电电泳分选是在微流控芯片外加一个不均一的电场，对介电特性不同的细胞进行迁移分离，特异性高，能较好的保持细胞的活性。
iii. 螺旋线
c) 物理特性结合生物学特性
应用到的技术手段还有droplet 微滴、微流控。
不同技术和产品都有各自优势。40路诸侯割据，太多了吧，所以现在新进入这个领域在国际上不多了，该逐鹿中原、看谁是王者！或者“分久必合”了。在此想了一个标准来评判不同产品，属个人意见：
1) “抓得到”是王道- 在多少种癌症N，多大比例%病人中能分离/捕获到？
2) “抓得多”是王道 – 单个检测获得的个数 n
3) “抓得纯”价值高 – 杂细胞数量 %
4) “抓的全”要加分 – EMT、不同分型、早期/晚期各个阶段
5) 临床数据多，已有用户多
6) 结果可重复性好 – CellSearch的王牌
7) 有“证”是硬道理 – FDA是金牌、CFDA是银牌、CE认证是铜牌、检验所/基因测序资质可以“摸鱼”
鉴定- CellSearch定义了CTC – 免疫荧光显微镜下，CK/EpCAM阳性；Nuclear阳性；CD45阴性；并观察细胞形态。FDA也批了这个定义。“金”标准（镀金）可是这里包括了其它上皮细胞！假阳性、假阴性仍是挑战。也可以用其它蛋白标记染色- 如N-cadherin, Vimentin 对于EpCAM缺失的EMT的细胞， 或者组合标记物，或者PLS3等。更进一步的鉴定 – 荧光染色后，结合基因分析 （qPCR, ddPCR, FISH，单细胞分析等）。
CTC检测主要由两个技术环节构成：分离与鉴别，也就是人们常说的“抓得着”与“看得见”。分离与鉴别方法的有效性决定着CTC检测的灵敏度与特异性。让我们首先看看人们是如何解决“抓得着”CTC的问题的。目前，国内外各种分离CTC的技术手段基本可归为3大类：过滤法，捕获法及富集法。
过滤法：代表技术为ISET（isolation by size of epithelial tumor cells）。该方法使用孔径为8 微米的细胞筛过滤去除4-5微米的白细胞，从而达到分离较大的 CTC 的目的。本方法的最大优点在于便捷。然而随着近年来人们对CTC了解的不断加深，发现很多CTC实际上与白细胞一样大，有些甚至只有白细胞的一半或更小。目前有证据显示，这些小或超小CTC的数目比例在有些瘤种中可高达1/3。人们对于这些小的CTC显然不能视而不见。实际上有关过滤法灵敏性较低的客观评价国外已有多篇报道，而这些小CTC的特殊重要临床意义也已经引起了人们的密切关注 (Alunni-Fabbroni and Sandri, 2010, Methods 50:289；Coumans, etal., 2010, Ann. Oncol. 21:1851）。
捕获法：主要代表方法为CellSearch及微流体(microfludics)。该方法的原理是将抗 CTC 表面特定蛋白标示物 (EpCAM) 抗体与磁珠或微流体进行偶联，利用这些固相载体上的抗体直接从血中捕获 CTC ，也就是人们常说的钓鱼法。该方法的优点是简便，但是近来人们发现，间质化肿瘤细胞 (Gorges, etal., 2012, BMC 12:178) ，以及许多循环肿瘤干细胞 (Zhang, etal., 2013, Sci. Transl. Med. 5:180)，尤其是多种不同组织来源的肿瘤细胞上并不表达此特定蛋白EpCAM。最近的研究显示，在检测的134种不同肿瘤标本中，高达30% 肿瘤的EpCAM为阴性(Went, etal, 2004, Hum. Pathol. 35:122)。这种依赖肿瘤细胞自身生物学特性的方法极大地限制了应用该方法检测不同肿瘤的CTC，而且分离的 CTC 被免疫磁珠所包裹，且又被抗 EpCAM 抗体活化(Munz, etal., 2009, Cancer Res. 69:5627; Veillete, et al., 1988. Cell 55:301) ，故不适于多种后续研究。
富集法：原理是有效去除血液中的红细胞、白细胞及血浆等组份，从而达到富集非血源性CTC的目的。该方法不依赖于肿瘤细胞表面标示物 (如EpCAM）的表达，且不受CTC大小的影响，因而可以有效富集各种不同肿瘤来源且大小不同的CTC 及癌栓（circulating tumor microemboli, CTM)。富集后的CTC没有被抗体触及，维持了较好的自然状态，可适于后续一系列分析。富集法又可分为阴性富集（negative enrichment）及差减富集（subtraction enrichment, SE)。两者最大的区别在于不同于阴性富集的低渗裂解红细胞，SE选择了非低渗溶破法去除红细胞，因而避开了对CTC的低渗损伤，从而使得到的CTC适于后续的原代肿瘤细胞培养、单细胞分析等。自从赛特生物与北京协和医院在2009年共同报道了早期SE方法可有效富集各种肺癌CTC细胞，并发现86%的肺癌复发病人其CTC为阳性后（Wu etal.2009，J. Thorac.Oncool. 4:30), 优化后的SE方法已被广泛应用于多种肿瘤CTC的研究与临床应用 (Li etal, 2014, Oncotarget 5:6594；Chen etal, 2013, CCA 219:57)。
大家对如何“抓得着”CTC的各种方法已经有了比较全面的了解，我们再看看人们是怎样解决“看得见”CTC的问题的。CTC的鉴别方法主要分为多重PCR，免疫荧光染色及荧光原位杂交（FISH）等。
多重PCR (multiplexPCR) 与RNA探针检测：多年前人们已从技术上解决了利用多重PCR手段对微量稀有细胞进行检测的技术难题，可在2 个肿瘤细胞上进行多基因检测。但时至今日，无特异性肿瘤标示物或基因一直还是困扰人们的难题，基于特异性较差等原因，此方法已不再是人们关注的重点。
近年来，美国Affymetrix公司发明了使用RNA探针检测CTC的技术，可帮助人们在mRNA水平对CTC进行检测与研究。但其实际意义还有待于较大样本的临床验证。
抗体染色：实体肿瘤细胞一般均为上皮来源，细胞内会表达角蛋(cytokeratin, CK) 或其他肿瘤标示物 (如HER2)。借助免疫荧光染色，可对来自实体瘤CTC 中的瘤标进行识别，从而达到检测CTC的目的。这也是目前检测CTC的最常见方法。然而近年来大量的临床实验数据显示，在CTC形成过程的间质化(EMT)阶段，与EpCAM相同，大量的CK也会降解(Willipinski-Stapelfeldt etal, 2005, Clin. Cancer Res. 11:8006)，从而在CTC检测过程中出现因“看不见”而造成的假阴性。
免疫荧光染色-FISH检测 (iFISH)：染色体荧光原位杂交(FISH) 技术检测染色体数目异常的肿瘤细胞早已被人们广泛接受。但有别于常规的FISH方法，iFISH的技术原理是将免疫荧光染色与FISH进行了有效整合，在区分血源性与非血源性细胞的基础上，对CTC细胞同时进行染色体异倍体检测与任一瘤标表达的检测。相对于单一使用免疫荧光染色或FISH方法，iFISH可将染色体或瘤标异常的CTC有效检测出来，从而极大地提高了检测的灵敏性与特异性。此外，根据同一CTC上的瘤标表达与染色体数目，可将CTC进行亚类分型，每一不同亚类的CTC细胞在肿瘤的耐药、药敏、转移与复发等方面都有着不同的临床意义。
随着人们对CTC了解的不断加深，各种新的CTC检测手段也会不断出现。