PrecisionMed_ NanoString技术方法

---

NanoString nCounter System是一种高通量的RNA表达检测方法，目前也主要应用在RNA表达量的分析方面。上海地区目前使用该仪器的有交大、复旦、中科院和药明康德四家。

2008年3月，《NatureTechnology》杂志曾以封面文章的形式报道了NanoString的数字基因表达谱技术，可见其非同一般。根据发表在《NatureTechnology》的文章显示，它将此平台与芯片、TaqManPCR和SYBRGreen定量PCR进行了比较，发现nCounter系统比芯片更为灵敏，与实时定量PCR的灵敏度相似。研究证明NanoString技术在所有转录本水平的基因表达模式与实时定量PCR有着极佳的关联。

NanoString实验过程解析

1.NanoString实验过程中需要用到的探针是一对、一对的。每对探针分成：Capture探针（捕获探针）和Report探针（报告探针）。

其中capture探针是一段带有50 mer 的核酸及Biotin，能将目标分子捕获并停留在由Avidin组成的Cartridge上。它的作用是把目标mRNA给抓住，并固定到玻璃板上。

Report探针是一段带有50 mer 的核酸及不同荧光颜色排列组合而成的探针，为主要的信号来源。它一方面与目标mRNA相结合。另一方面，它带了一串6个彩色的小珠子，通过小珠子的颜色和排列，光学识别软件可以在后期识别过程当中，把不同的report探针给识别出来，并加以区分、和统计。

2. 每一对探针，都针对一个特定目标基因的mRNA。把含有mRNA的样本裂解液与探针进行孵育杂交。让Capture探针和Report探针与目标mRNA相结合。

3. Capture探针和Report探针与目标基因的mRNA相互补。其中，Capture探针是对应于目标mRNA的5'端。而Report探针是对应于目标mRNA的3’端。【 Capture探针上，带了一个生物素，Report探针上，带了一串6个彩色的小珠子】。这个生物素，将与Cartrige的玻璃表面上所包被的链霉亲合素相结合【这个Cartrige也就是反应芯片】。Capture探针就这样被锚定在玻璃表面。同时，也把目标RNA连同结合在一起的Report探针，一同锚定在玻璃表面。

4. 通过一系列的杂交、洗脱过程，把游离的、没有结合到目标mRNA上的探针，都给洗掉。

5.目前的Report探针上有6个彩色的小珠子，老版的Report探针上会有8个彩色的小珠子。每个小珠子有：红、黄、蓝、绿，4种颜色可选。每个珠子的直径是200纳米。通过珠子色彩的排列、组合，可以得到足够多种多样的变化。但是，相邻的两个珠子是不能同一种颜色的。这样设计，是为了便于后期软件对珠子的颜色进行识别（每次实验，最多可以测800种探针。也就是说一次最多可以测800种基因的mRNA）。

6. 把Cartrige放到PrepStation光学扫描仪上。在Cartrige上通上电场。因为Report探针上的彩色珠子都是带电荷的，这些珠子就在电场的作用下倒向一边，并且被拉直。

7.光学扫描仪对着玻璃板进行扫描，读取信息。一个Cartrige上有12个通道，也就是一次实验可以做12个样本。每个cartrige的价格在大约900美金。

8.将cartridges移动到 Digital Analyzer进行信号数据采集，计数在Cartridge表面上的荧光编码探针并且将其列表标识。

总体步骤大致如下图：

NanoString nCounter System还可以用做蛋白水平表达的研究，目前只能做30多种蛋白的表达水平测定，方法的原理是：

1.把与蛋白一一对应的特异序列的单链DNA标签通过一段可以被光解的linker连接到相应的蛋白抗体上；

2.抗体-DNA标签复合物与相应的蛋白结合；

3.收集特异性结合的抗体-DNA标签复合物；

4.光照裂解linker，释放DNA标签；

5.利用nCounter的报告探针和捕获探针检测DNA标签的数目，即可得到相应蛋白的表达数量。利用高灵敏度的nCounter系统检测少量细胞甚至单细胞多达800种不同蛋白的表达水平，而这是免疫组化技术和免疫印迹技术所不能达到的。

NanoString nCounter System也可以用来检测microRNA，方法的原理是用桥接的方法，利用一段设计好的，互补的RNA链，把目标microRNA链和另外一个设计好的标签RNA链，杂交在一起。再用RNA链接酶，把这两段RNA连成一根RNA链。连完之后，把多余的桥接RNA、标签RNA都去掉。再用NanoString的方法定量检测。

另外药明康德也用NanoString做肺癌的融合基因检测（ALK、ROS1、RET、NTRK1），不过只是科研项目，并不用做临床诊断服务项目，市场收费一个样本在3~4千元。

NanoString仪器在国内使用的优缺点：（个人观点）

优点：

1.可适用于严重降解的RNA样本，如：FFPE样本。石蜡样本当中的RNA，往往是严重降解的，许多分子生物学实验都很难处理，但是NanoString可以很好地分析石蜡样本当中的RNA，最短可以检测到100bp RNA。

2.不必抽提RNA，直接可以用FFPE样本的裂解液，或者细胞的裂解液来做实验（只需要100ng即可做出很好的实验结果）。

3.实验全程中无酶参与反应，无需RT-PCR进行反转录，也无需PCR进行扩增，直接检测RNA的分子数量。

4.通量方面，一次最多处理12个样本，每个样本最多测800个targets。

5.实验操作方面：手工操作部分大概只有十几分钟，其余的步骤，都可以由

机器来完成，自动化程度高，操作简单，重复性好，数据比较精确。

6.荧光条形码探针标记，单分子计数。

7.NanoString另外提供element试剂盒，将应该分子条形码与探针分开，研究者可根据自己的需要灵活合成各种探针，用GPRs与探针杂交后与靶基因杂交，从而对靶基因进行分类和计数（Element方法的原理，就是把Report探针拆成2段。一段是和目标mRNA序列相结合，另外一段，是连到彩色的小珠子。同时，也把Capture探针分成2段，一段是连到生物素的，还有一段，是和目标mRNA相结合的。这样设计的效果，就是只要换中间普通探针的序列，就可以探测不同的目标mRNA了。而普通探针的价格，是远低于Report探针的）。

缺点：

1. NanoString仪器的国内代理商仅台湾冷泉港一家，探针的设计和合成需在美国完成，我们只需提供rs号，探针合成周期大约在1~2个月，时间比较长，合成后需要保存在-70度空运回来，过安检很麻烦，个人觉得成本会很高。

2.NanoString 仪器的一个Cartrige上有12个通道，也就是一次实验可以做12个样本，每个cartrige的价格在大约900美金。

3. 每（一个）反应、每（一对）探针的价格，大概在0.5到3个美元之间，NanoString的Report探针是比较昂贵的，量多的情况下跟qRT-PCR试剂的masterMix 成本差不多，如果量少就会比qRT-PCR成本高。

4，目前临床和NCCN的金标准是FISH检测方法，该方法只和qRT-PCR方法进行过对比，符合度在0.9999，但是并没有和金标准FISH做过对比（仅有药明康德跟FISH做过对比，并且列数不多），所以以临床形式推出报告可能不太适合，只能以科研形式出具报告。

NanoString的方法，相对于FISH方法，有以下的优点：

· 第1，NanoString方法能在一个反应当中，把四种基因的、已知的59种融合基因突变类型都检测到，而FISH，一次反应，只能检测一种基因的融合基因突变。

· 第2，NanoString方法除了能检测已知的融合基因突变还能发现未知的融合基因突变。

· 第3，NanoString方法的自动化程度相当高，相比于FISH方法，它可以节省大量的人工成本。

· 第4，NanoString检测结果是由机器来读数，客观程度相当高。

NanoString的仪器，分成一大、一小这样两台仪器。大的仪器，是做化学反应的(nCounterPrep Station)。小的这台仪器是做光学扫描读数用的（nCounterDigital Analyzer）。

2013年9月，美国FDA批准NanoString公司的Prosigna方法。Prosigna是针对乳腺癌进行分型，和预后评估的一种方法。这个方法，分析PAM50基因的表达量，PAM50是PredictionAnalysis of Microarray 50（的缩写）。它是医学界公认的，可以对乳腺癌进行分型，并且进行预后评估的标准。目前，Prosigna方法，已经在北美和欧洲有较多的应用。在近期，该项panel已经被纳入了美国的保险公司投保范围内了，可见NanoString的技术含量以及美国对生物医疗行业的重视程度了！

内容转载请注明出处来源！(Precision_Medical)