Primer 3.0丨简单快速的一代测序引物设计软件

说到测序，普遍就是一代和二代测序，二代测序我们一般只需要提供基因的名称，bed文件或者基因region区域等（参考基因组要明确），便可在相应的Illumina和Ion AmpliSeq等网站进行引物的设计（一般探针合成公司都会帮忙设计）。

今天主要说说传统的一代测序引物设计，一代测序引物设计的软件有很多，Primer 3.0，Primer 5.0，DNAstar，NCBI Primer-BLAST等等，说到简单快速，还是推荐使用Primer 3.0在线设计版，并且设计的成功率很高：

Primer 设计流程

首先，设计引物之前，我们需要查找相关基因的序列，现以EGFR基因的L858R位点为例，进行设计：

1，查找EGFR基因的序列。可以使用NCBI（National Center for Biotechnology Information）网站或UCSC（University of California Santa Cruz）网站，下面以NCBI为例进行介绍：

NCBI及UCSC查找gene序列

查找EGFR基因序列（选择人类）

基因的序列有FASTA和GenBank（Graphics指Sequence Viewer）

FASTA格式

GenBank格式

2，得到EGFR基因序列之后，下一步将基因序列粘贴到word中，找出L858R位点在EGFR基因序列中的位置（L858R：c.2573T>G，GRCh38, 7:55191822..55191822, view Ensembl contig）,也可以根据L858R的rs号：rs121434568，进行序列比对，找出突变位点在基因序列中的位置。

L858R c.2573 T>G 在EGFR序列中的位置

找出突变位置后，我们需要在突变位置前后各选取50bp左右的位置，加上“[”和“]”的括号（如下图所示），[ ]里面的内容其实是扩增的目的区域，一代测序一般前面20-30bp是没办法使用的，所以FWD引物可以选择离检测突变位点50bp左右的位置：

L858R 上下游50bp左右位置加上[ ]

3，打开 http://primer3.ut.ee/ 网页：

http://primer3.ut.ee/

选择[ ]上下游几百bp的序列，并将选择序列粘贴到Primer3的方框中，此时其他选择键默认不动就可以，当然也可以根据自己的要求进行选择，比如引物长度（primerlength）、产物长度（product length）、序列Tm值(melting temperature)、引物及产物GC含量（composition）等：

选择[ ]上下游几百bp的序列

序列粘贴到Primer3的方框中

4，然后点击pick primers键，即可显示出设计的引物：

此时的引物，不论是引物长度，TM值，GC含量，还是发卡结构及引物二聚体等都是没有任何问题的，所以说引物是可以直接合成使用的，此时有人可能会有疑问，3'端有A，此引物会不会有问题？一般3'端碱基序列最好是G、C、CG、GC，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，但是并不是说所有的A都会失败，所以依据小编的经验，基本上3'是A，但是其他参数也非常好，引物的成功率还是在95%以上。

当然，如果你不喜欢3'端有A，那也没有关系，因为下面有很多的备选引物方案可供选择，下面的引物依然可以使用。这时候便可随心所欲了，是不是很开心。

备选引物方案

到此，一代测序的引物便设计完成，是不是很简单，有空大家都可以去试一试哦！

TIPs

如果设计mRNA序列的引物，可以选取cDNA序列（cDNA序列，mRNA逆转录出来的是cDNA, 全称complementary DNA）， 一般cDNA比CDS要长，表达出来成为蛋白质的RNA部分属于CDS序列，CDS全称为 Coding Areas。

mRNA序列 vs cDNA序列

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