讲真的，MMR基因与TMB，MSI-H，PD-L1的关系，你需要了解一下！

讲真的，随着肿瘤免疫学和分子生物学的迅速发展，人们对肿瘤免疫治疗有了新的认识和了解，肿瘤免疫检查点抑制剂（ICIs/ICBs）由于其针对性强、副作用小等优势受到人们的重视，也是目前肿瘤免疫治疗的主要药物，ICIs通过抑制肿瘤细胞的免疫逃逸，调动自身的免疫系统功能进而消灭肿瘤。

本公众号也曾一度对ICIs及其相关Biomarker进行过科普，不熟悉的同学可以去翻看历史消息进行了解。说到ICIs的Biomarker，不得不提MMR，MSI，PD-L1，TMB，因为这四个Biomarker是最常见的也是最常使用的：

它们之间的关系，可以大致描述为：[ TMB（dMMR=MSI-H）] vs PD-L1。但是细心的读者会发现，我们在前面介绍“MSI”的时候，就有提到MMR缺陷并非影响给定肿瘤中的所有微卫星，MSI-H取决于哪一个MMR基因突变，比如对于具有MLH1突变的患者，敏感性为80%，具有MSH6突变的患者，它仅为55%，也就是说实际上为MSI-H的患者仍可以呈现出MSI-L或MSS。

今天我们聊聊 ASCO  2018 上的一项关于MMR四个基因与TMB，MSI-H，PD-L1关系的研究：1057例MSI-H肿瘤中，MLH1、MSH2、MSH6、PMS2对TMB及PD-L1表达的影响。

背景知识

1，免疫检查点抑制剂（ICIs）已经彻底改变了癌症治疗（带来了革命性的变化），ICIs在一小部分患者中，出现了显著和持久的临床反应；

2，目前的研究已经显示，ICIs的响应与MSI-High状态、TMB-High和PD-L1过表达密切相关；

3，在实体肿瘤中，TMB-High和MSI-High的比率和PD-L1过表达差异显著；

4，虽然大部分MSI-H肿瘤表现为高TMB和PD-L1过表达，但TMB水平与MMR个体基因改变的确切关系尚不明确；

因此，此项研究旨在评估1057例MSI-H肿瘤中不同类型肿瘤TMB水平与4个MMR基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）改变之间的关系。

方法学

患者信息：描述为MSI-H的肿瘤样本是经Caris Life Sciences公司在2015年至2018年1月间检测分析的。Caris生命科学公司成立于1996年，是全美最大的专业从事肿瘤基因诊断的机构。

NGS检测：使用NextSeq平台（Illumina，Inc.，San Diego，CA）的592基因panel进行NGS检测。

MMR检测：MMR蛋白表达使用IHC方法（免疫组化法）检测，抗体克隆号为：（MLH1为M1抗体；MSH2为G2191129抗体；MSH6为44抗体；PMS2为EPR3947抗体；（Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，AZ，USA））。 dMMRP是蛋白质表达完全丧失（在100％的细胞中为0+）

MSI检测：利用7000多个目标微卫星位点检测微卫星不稳定性，并与参考基因组进行比较，对每个样本进行微卫星改变位点的计数。将2000多例匹配临床病例的结果进行了MSI-NGS结果与传统PCR方法的分析和比较，敏感性> 95％，特异性> 99％。

TMB检测：肿瘤突变负荷（TMB）是通过计算每个肿瘤中发现的所有非同义错义突变（之前未被描述为胚系突变）来衡量的（每个肿瘤测序采用592个基因panel，区域大小为1.4 MB）。定义TMB-High的阈值大于或等于17个突变/MB，并且通过在CRC病例中通过片段分析比较TMB和MSI而建立的。

PD-L1检测：PD-L1的IHC检测采用一级抗体SP142 （Spring Biosciences）进行分析。如果阳性细胞百分比为5%（或以上），且在肿瘤细胞膜上的强度为2+，则认为染色为阳性。

统计分析：采用方差分析和卡方检验进行比较。

结果分析

1057例不同肿瘤类型MSI-H的样本

图1：TMB（A）和MMR改变频率（B）在CRC肿瘤、子宫内膜肿瘤和“其他”肿瘤分组中的情况：

1，与MSI-H EC患者（23 mt / MB）及“所有其他”患者（31 mt / MB）相比，MSI-H CRCs具有最高的TMB（39 mt / MB）（P <0.0001）。

2，最常见的MMR改变（IHC丢失或突变）基因是跨越癌症类型的MLH1和PMS2。 MSH2和MSH6在CRC中比子宫内膜癌更频繁地改变（分别为21％ vs. 5％和49％ vs. 28％，p <0.0001）。

图2，TMB在MLH1、PMS2、MSH2和MSH6改变的所有肿瘤组（A）和CRC组（B）的情况：

总体而言，MSH2或MSH6的改变与TMB-H关系（分别为48.5和40.1 mt/MB）高于MLH1或PMS2的改变与TMB-H的关系（两者均为27 mt/MB）。

在CRC、子宫内膜癌和其他癌症类型也有类似的影响，见图2，3。

图3，TMB在MLH1、PMS2、MSH2和MSH6改变的子宫内膜癌（A）和其他肿瘤（B）中的情况：

图4，TMB在MMR基因中一个、两个或三个改变分组中的情况：

MSH2/6共改变的肿瘤（占所有肿瘤的4%）与MLH1/PMS2共改变的肿瘤（占所有肿瘤的39%）相比，具有更高的TMB (50 vs 24 mt/MB);P < 0.0001)。

图5，所有肿瘤(A)，子宫内膜肿瘤(B)， CRC (C)和其他肿瘤(D)中MS位点的改变：

子宫内膜癌中MSH2/6的改变与更多的微卫星改变有关（MSH2：88，MSH6：73；MLH1：68；PMS2：68，p<0.0001），而在CRC中，所有的MMR基因相对平等，都差不多。

图6，可以看到PD-L1的表达在MLH1、PMS2、MSH2和MSH6改变的群组差异(A)和移码(fs)突变中，这四组之间存在显著差异(B)：

与MSH6(16%)、MLH1(16%)或PMS(14%)相比，MSH2(23%)肿瘤的PD-L1过表达频率更高，P = 0.01。

在CRC中，MSH2的改变与BRD4，ARF，PAX7，ARHGEF12，EBF1，SPECC1，SDC4，NFKBIA和MYCN的fs突变显著相关。

在子宫内膜癌，MSH2与其他36个基因中的更高的fs突变相关。

结论

1，不同肿瘤类型之间MMR基因改变的发生率不同。例如，MSH2和MSH6在CRC中比子宫内膜癌更频繁地改变。（最常见的MMR基因改变是MLH1和PMS2，但是似乎MSH2和MSH6基因的改变，与TMB，MSI及PD-L1的关系更密切）

2，在多种癌症类型中，MSH2和/或MSH6改变比MLH1和/或PMS2改变与更高的TMB有着显著的相关性。（MSH2/6共改变的肿瘤（占所有肿瘤的4%）与MLH1/PMS2共改变的肿瘤（占所有肿瘤的39%）相比，具有更高的TMB (50 vs 24 mt/MB)；MSH2或MSH6的改变与TMB-H关系（分别为48.5和40.1 mt/MB）高于MLH1或PMS2的改变与TMB-H的关系（两者均为27 mt/MB））

3，TMB在MSI-H的肿瘤中显著不同，与MSI-H子宫内膜癌和其他MSI-H实体瘤相比，MSI-H CRC具有最高的TMB。此外，左侧CRC肿瘤显示比右侧CRC肿瘤有更高的TMB。（即使都是MSI-H的肿瘤，TMB-H的值也不一样，在结直肠癌是具有最高的TMB（中位值：39 mt / MB））

4，改变的微卫星位点与TMB水平之间有着显着的关联。此外，MSI-H，TMB状态和微卫星位点之间的关联性跟肿瘤类型是相关的。（不同肿瘤类型的MSI-H，TMB-H关系是不一样的；比如在子宫内膜癌中MSH2/6的改变会导致更多的微卫星改变，但在结直肠癌中四个MMR基因的改变与微卫星改变是一样的）

5，在所有肿瘤类型中，PD-L1过表达的频率与MSH6（16％），MLH1（16％）或PMS2（14％）的改变相比，在MSH2（23％）改变的肿瘤中明显升高。（MSH2基因或蛋白改变虽然发生频率不高，但是与PD-L1表达（TMB-H）的关系高）

6，此项研究结果表明特定的MMR基因的改变可能对MS插入，移码突变或微卫星位点长度和TMB水平有不同的影响。（MMR基因其实有12个，其中最主要的4个基因是：MLH1、PMS2、MSH2和MSH6（数据积累最多），它们的改变对于MSI及TMB会带来不同的影响）

7，进一步研究MSI-H肿瘤的生物学、病因和最佳治疗仍是适宜的。（FDA 2017 已经批准MSI-H适用于泛实体瘤）

8，此项研究正在进行进一步的分析，以评估特异性MMR基因改变与检查点抑制剂（ICIs）反应之间的相关性。（MMR的某单个基因改变肯定会对ICIs的治疗有明确的相关性，值得研究与期待，此外MMR基因还与某些基因的）

基因Talks的简单总结：不同肿瘤类型的MMR基因突变频率不一样。此外，MMR基因的功能和权重是不一样的，MMR基因变异（蛋白缺陷）要具体看是哪个基因（蛋白），因为不同的MMR基因变异（蛋白缺陷）会对MSI-H，TMB-H以及PD-L1过表达产生不一样的影响。MLH1和PMS2的突变频率更高，但是与MSI-H，TMB-H及PD-L1过表达的关系较低，MSH2和MSH6的突变频率较低，但是与MSI-H，TMB-H及PD-L1过表达的关系较高。

参考文献：

1. Le DT, et al. Science 2017; 357: 409-413.

2. Hellmann MD, et al. N Engl J Med 2018. DOI: 10.1056/NEJMoa1801946

3. Goodman AM, et al. Mol Cancer Ther 2017; 16: 2598-2608.

4. Salem ME, et al. Mol Cancer Res. 2018 May;16(5):805-812.

5. Salem ME, et al. JCO 2017 35:15_suppl, 11517-11517

6. Maleki Vareki S, et al. Crit Rev Oncol Hematol 2017; 116: 116-124.

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