GRAIL｜cfDNA甲基化C位出道，理性看待液体活检早筛“圣杯”！
没有任何一个产业的基建不是在质（泡）疑（沫）中完成的，癌症早筛也不例外。
"有使命的公司未必优秀，优秀的公司必有其使命。
GRAIL，一家致力于用液体活检技术开发新一代癌症早筛产品的公司，其使命（mission）是：“在可治愈的早期发现癌症”，值得被称赞。
这家总部位于美国加州门洛帕克的癌症早筛公司最近备受大家关注。2016年1月，它作为基因测序公司Illumina（ILMN）的一个子公司成立，2017年3月，从Illumina剥离并陆续获强生及亚马逊等公司近20亿美元融资，承诺开发一种基于血液的癌症早筛产品；2020年9月9日，GRAIL申请IPO，并计划于2021年以LDT方式推出一款50余种癌症早筛产品Galleri，用于50岁以上无症状人群癌症筛查，再一次将癌症早筛推向了一个高潮。
Galleri产品尚未上市，目前仅适用于GRAIL临床研究的参与者。
截至目前，Illumina仍是GRAIL最大单一股东，持股14.6%。面对GRAIL的上市申请，Illumina简单说了句：“HOLD ON！”，并欲以80亿美元的价格收（豪）购（夺）GRAIL这个癌症早筛领域的“香饽饽”。
有时候，你努力一下，就会发现有钱是真的能为所欲为。2020年9月21日，Illumina宣布收（抢）购（回）GRAIL，没错，80亿美元（包括35亿美元现金和45亿美元Illumina普通股），1 真香！
GRAIL的癌症早筛技术，现已锁定在了cfDNA甲基化上（cfDNA甲基化表现显然已经超过cfDNA突变及cfDNA全基因组拷贝数），简言之，就是通过一管血液的cfDNA靶向甲基化检测，便可对数种目前已有或数十种目前尚缺乏筛查方法的癌症进行相对低成本的筛查，从而提高存活率。
DNA甲基化异常是驱动癌症发生发展的重要机制，与基因变异有着等同亦或更大的作用，且往往发生在癌症病程的早期。肿瘤抑癌基因启动子区域的DNA高甲基化（TSG沉默）或致癌基因启动子区域的DNA低（去）甲基化（OG激活）都将会导致肿瘤关键信号通路的异常改变，进而使正常细胞发展成为肿瘤细胞。（一般来说，甲基化程度没有突破一定的阈值，细胞会自我修复）
DNA甲基化是重要的表观修饰之一（DNA的一种化学修饰），可以在不改变基因序列的情况下控制基因的表达。基因启动子区域DNA甲基化，是指在DNA甲基化转移酶的催化下，选择性将胞嘧啶（C）核苷酸嘧啶环的5碳上连接一个甲基化基团，形成5-甲基胞嘧啶。血液cfDNA经重亚硫酸盐处理后，甲基化的C不会发生变化，未被甲基化的C则会转变成U，最后采用基因检测方法检测就可以了。癌症早筛，cfDNA甲基化以C位（胞嘧啶）出道了！
cfDNA甲基化“C位”出道！
癌症早筛广泛存在的一个问题是过度治疗，2016年《Nature》杂志就发表过一篇关于癌症筛查的综述称：“癌症筛查的挑战在于，很难让健康人群的生活比现在更好，但让他们生活的更糟糕却并不那么困难”。
的确，很多人不愿意去做早筛的原因是怕受到无辜的惊吓，进而惶惶不可终日，同时，患者可能需要接受额外的检查（活检、影像等）来验证癌症的存在，这些检查压力大，费用昂贵，而且有侵袭性。所以癌症早筛，一定要确保预期的受益大于潜在的风险。
如此，应理性看待癌症早筛，理性看待液体活检早筛“圣杯”：GRAIL！
2020年3月30日，ESMO官方期刊《annals of oncology》（IF=18.274）发表了GRAIL公司一项cfDNA靶向甲基化液体活检分析方法在50余种癌症早筛领域的研究数据。2
这也是CCGA（Circulating Cell-free Genome Atlas，循环细胞游离DNA基因组图谱）项目三个子研究中研究2（CCGA-2）的成果：扩大训练集与验证集样本进一步验证。
CCGA研究1/2将6,689例参与者（2482例癌症患者（>50种癌症类型）和4207例非癌症患者）分为训练集和验证集，对血浆cfDNA进行靶向103,456个甲基化区域（17.2Mb）的亚硫酸氢盐测序（甲基化标记筛查技术），随后训练出一个分类器，并对癌症检测和组织溯源（TOO）进行了验证。
▲ 基于cfDNA甲基化多癌症检测方法的开发和验证：甲基化生物学将癌症与非癌症区分开来
血浆cfDNA量：最大75ng；
杂交捕获；
Illumina NovaSeq PE150测序；
中位深度：139X；
该文的重点内容如下：
① cfDNA靶向甲基化分析方法可同时检测和定位50余种癌症，包括缺乏筛查指南的高死亡率癌症；
② 可在所有阶段中检测出癌症（I-III期灵敏度：43.9%；I-IV期灵敏度：54.9%），特异性为99.3%，单一假阳性率为0.7%（FPR）；
③ 在检测到癌症信号时，还能以93%的准确度定位癌症的组织起源，这对于指导后续护理至关重要。
▲ cfDNA靶向甲基化检测的性能指标
2020年5月3日，《annals of oncology》（IF=18.274）刊登了W.C. Taylor的信件，认为GRAIL开发人员在方法问题和结果上存在误导性的描述，应削弱检测的实用性。3
该信件指出，尽管作者正确地强调了筛查假阳性结果的风险和危害，但他们以一种误导性的方式描述了他们研究的假阳性结果。
当无症状的病人从癌症早筛检测中得到阳性结果时，他们和他们的临床医生需要知道检测结果出错的可能性（此处指的应是错误发现率）。因为作者用假阳性率来表示无癌人群中假阳性结果的比例，所以他们说假阳性率为0.7%。
Taylor表示，根据作者的假设（敏感性54.9%，特异性99.3%，预检概率1.3%），阳性检验中的假阳性比例为49%（691/1406），而不是作者指出的0.7%。这种高假阳性检测率将会导致相当大的“后续发病率和心理、身体和经济成本”，这不是早筛希望看见的结果。
对此，GRAIL人员表示本研究的设计并不是为了确定该试验在无症状人群和潜在未来意向使用人群中的效果，因此，他们说的0.7%假阳性率是符合标准的假阳性定义的。
假阳性率（FPR）=1-特异性，通常会与错误发现率（FDR）相混淆，特异性=真阴性结果除以非癌症参与者的总数（假阳性b+真阴性d，即d/b+d），在验证集中，特异性为99.3%（606/610），所以FPR为0.7%。（当然，两者所站立场不一样）
此外，在预测值的计算中，Taylor表示GRAIL不恰当地选择了所有侵袭性癌症的年发病率来估算预检概率。正确选择其实应该是无症状人群的癌症患病率。如果基于流行率的适当预检概率低于错误选择的年发病率，则阳性检测结果为假阳性的比例将会高于49%，这带来的后果将会更严重。在这点上，GRAIL人员也表示同意，他们目前仅简单的使用了发病率而不是流行率，使用流行率似乎是更合乎逻辑的。
最后，Taylor表示GRAIL错误地将灵敏度计算为已知癌症患者的检测阳性率。在早筛试验中，相关组应由无症状人群组成，而不是癌症患者。
2020年7月30日，《annals of oncology》（IF=18.274）刊登了C. Fiala和E.P. Diamandis的信件，对GRAIL证据批评指出，该公司报告的研究是通过比较无症状的受试者和已知有癌症的受试者来计算检测结果的。这与该检测用于筛查一般人群的方式不同，因此夸大了该检测的阳性预测值（PPV）。Grail公司声称其检测能够预防高比例的癌症死亡是基于数据模型，而不是实际经验，GRAIL开发人员夸大了检测的结果。4
该信件指出，GRAIL的预期临床应用是早期发现癌症（早筛早诊），特异性看起来非常显著，有99.3%；灵敏度因癌症类型和分期有所不同，在I期平均为18%，II期为43%，III期为81%，IV期为93%。但因所有的癌症已被临床确诊，所以，这项工作不能代表早筛的方案（即检测无症状的个体），并且，作为癌症早筛工具时，其真正的灵敏度可能会大大降低！在这种情况下，对晚期癌症的检测灵敏度是无关紧要的，因为它们可以通过症状检测出来。
Fiala等为了进一步验证其结论，根据该作者先前的报道，5 并假设最坏情况下I-II期肿瘤的灵敏度为10%（也可以解释检测无症状个体筛查时灵敏度降低的原因），把一个理论场景的特异性定为98%，因为在真实的筛查中，会有许多人患有不同的非癌症疾病（包括炎症），这可能会极大地降低特异性。另外，Fiala等还根据本次研究的数据设定了另一种场景情况：2 30%的灵敏度（本研究报告的I期和II期癌症敏感性的平均值）和99%的特异性。
基于这些假设，Fiala等计算了12种癌症（GRAIL对血浆cfDNA进行10万个靶向甲基化区域（17.2Mb）的亚硫酸氢盐测序，然后对50余个癌种进行了分类分析，由于篇幅有限，Fiala等在此侧重于12个癌种的讨论）试验的阳性预测值（PPV）。
PPV表示得到阳性检测结果的人实际患癌的几率（真阳性）。
▲ 基于两种不同灵敏度/特异性下12种常见癌症的阳性预测值（PPV）
如果一个人得到了阳性的检测结果，那么在最好的情况下，他们患癌症的几率仍然很低（大部分是10%），当然这取决于癌症的类型。患者可能需要接受额外的检查（活检、影像等）来验证癌症的存在，这些检查压力大，费用昂贵，而且有侵袭性。最终，这项检测的大多数阳性患者（>90%）将是假阳性。大多数癌症患者（>70%）会因为灵敏度低而被忽略，并给他们提供错误的心理安慰。
一般来说，即使特异性有限，这种早筛最好能在高灵敏度下进行，以丰富患病人群（增加患病率），然后让他们接受更复杂的检测项目，比如结肠癌便隐血检测，之后再进行结肠镜检查。
另外，可接受的阳性预测值（PPV）取决于肿瘤类型和其他因素，比如，在临床肿瘤筛查的调研中，卵巢癌的绝对最小PPV为10%（生物标记物和经阴道扫描）。6 但在这种情况下，由于早期癌症患者血液循环中缺乏肿瘤源性cfDNA，cfDNA检测的敏感性可能无法进一步提高。
没有任何一个产业的基建不是在质（泡）疑（沫）中完成的，癌症早筛也不例外。Grail研究人员也表示同意，他们的研究并不是对无症状人群的筛查与验证，所以他们于今年启动了首个基于泛癌种早筛的前瞻性干预性临床试验——PATHFINDER研究（探路者计划，将招募约6200名患者，并至少观察一年时间），GRAIL的研究人员认为，他们的检测几乎不会产生误报的情况，然而，GRAIL的潜在投资者需要看到PATHFINDER的研究结果，才能知道该公司是否真的找到了癌症检测的所谓“圣杯”！
最后想说的是，癌症早筛虽是蓝海市场，不过蓝海市场的不确定因素太多，风险很大，建议“普通玩家”慎重进（入）驻（坑）。一项烧钱耗时的大工程，起落浮沉，又有几个能坚持到最后呢？
参考资料：
1.https://investor.illumina.com/news/press-release-details/2020/Illumina-to-Acquire-GRAIL-to-Launch-New-Era-of-Cancer-Detection/default.aspx
2.Liu M.C. Oxnard G.R. Klein E.A. Swanton C. Seiden MV, on behalf of the CCGA Consortium Sensitive and specific multi-cancer detection and localization using methylation signatures in cell-free DNA.Ann Oncol. 2020; 31: 745-759
3.Taylor W C,Comment on 'Sensitive and specific multi-cancer detection and localization using methylation signatures in cell-free DNA' by M. C. Liu et al.[J] .Ann. Oncol., 2020, 31: 1266-1267.
4.Fiala C,Diamandis E P,A multi-cancer detection test: focus on the positive predictive value.[J] .Ann. Oncol., 2020, 31: 1267-1268.
5..Liu MC, Maddala T, Aravanis A, et al. Breast cancer cell-free DNA (cfDNA) profiles reflect underlying tumor biology: the Circulating Cell-Free Genome Atlas (CCGA) study. J Clin Oncol. 2018;36:536.
6.Menon U, Gentry-Maharaj A, Hallett R, et al. Sensitivity and specificity of multimodal and ultrasound screening for ovarian cancer, and stage distribution of detected cancers: results of the prevalence screen of the UK Collaborative Trial of Ovarian Cancer Screening (UKCTOCS). Lancet Oncol. 2009;10:327e340.
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