浙大高长有、徐峰：负载地塞米松的活性氧响应聚酮缩硫醇纳米粒子抑制急性肺损伤炎症和氧化应激|Bioactive Materials

近期，浙江大学高长有教授和徐峰主任医师在科爱出版创办的期刊Bioactive Materials上联合发表研究论文：负载地塞米松的活性氧响应聚酮缩硫醇纳米粒子抑制急性肺损伤炎症和氧化应激。该论文发现具有活性氧（ROS）响应性的载药纳米颗粒（NPs），通过降低ROS及促炎因子水平、调节免疫和炎症相关通路，减轻炎症、提高小鼠生存率，有效治疗肺损伤。

01

研究内容简介

炎症是机体对内部和外部刺激的防御反应，有助于清除有害物质并修复损伤。然而，不受控制和过度的炎症反应会损伤细胞、组织和器官，从而对机体造成系统性危害。急性肺损伤（ALI）是由各种因素导致的肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞损伤，与宿主免疫系统不受控制的炎症反应有关。如果不及时治疗会发展为急性呼吸窘迫综合征（ARDS），例如全球正在流行的由新型冠状病毒SARS-CoV-2导致的肺炎（COVID-19）。然而，由于特效药较少并且到达肺部的药物浓度低，仍然缺乏针对 ALI 的有效疗法。在ALI的发展过程中，肺泡固有的巨噬细胞首先被激活为促炎的M1表型，释放促炎细胞因子，激活免疫反应，将血管和骨髓中的单核细胞及中性粒细胞等白细胞（WBC）募集到发炎的肺泡部位。随后，中性粒细胞被激活并进一步释放有害介质，如ROS、髓过氧化物酶（MPO）等，以消灭和降解病原体。如果病原体不能被及时清除，中性粒细胞会持续释放ROS，导致肺组织中积累大量的ROS。高水平的ROS不仅会导致上皮细胞损伤，还会放大炎症信号并增强免疫反应。因此，降低ROS水平是缓解肺部炎症的一种有效方法。本研究通过构建负载地塞米松（Dex）的ROS响应的NPs，以小鼠ALI为模型，研究其治疗效果，并通过转录组测序技术，揭示NPs发挥治疗效果的机制（图1）。

图1：负载Dex的ROS响应NPs（PTKNPs@Dex）治疗小鼠ALI。经尾静脉注射，PTKNPs@Dex在肺部聚集，并响应高浓度ROS释放药物，降低免疫细胞浸润和细胞炎症因子水平，减轻肺损伤。

一、NPs的制备与表征

通过水包油（O/W）乳化-溶剂挥发法制备空白（PTKNPs）和负载Dex（PTKNPs@Dex）的NPs，结果表明PTKNPs和PTKNPs@Dex呈均匀的球形，干态粒径为200 nm左右，水合直径分别为311 nm和307 nm，载药前后粒子的形貌和粒径未发生明显变化，具有优异的胶体稳定性，ROS响应性和清除性。在ROS环境下，NPs可以响应降解，释放药物（图2）。

图2：NPs的表征。（A）SEM和（B）TEM图，SEM和TEM的比例尺分别为1 μm和200 nm。（C）粒径分布图。（D）不同介质中粒子的粒径和zeta电位变化。（E）不同介质孵育一定时间后，粒子悬浮液透射率随时间的变化。（F）PTKNPs和PTKNPs@Dex的自由基清除能力。负载尼罗红的NPs与不同浓度的·OH和H₂O₂孵育后，（G）荧光强度和（H）尼罗红累积释放量随时间的变化。**表示p < 0.01，***表示p < 0.001，n.s.表示p < 0.05时没有显著性差异。

二、NPs体外炎症抑制作用

研究发现，NPs很容易被脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7细胞胞吞，且随着孵育时间的延长，NPs的胞吞量增加(图3)。被胞吞的NPs主要位于细胞质中，部分位于细胞核周围。表明NPs可以被激活的巨噬细胞迅速胞吞，从而使药物在炎症细胞内/周围释放，进而在体内和体外抑制炎症。LPS刺激后RAW264.7细胞中ROS过表达。PTKNPs由于其清除自由基的能力，与细胞共孵育后显著降低了胞内ROS水平，而free Dex组由于其固有的抗炎功能也显著抑制了ROS的产生，但PTKNPs@Dex对ROS的抑制作用最强。除此之外，PTKNPs@Dex能显著抑制LPS刺激的巨噬细胞中IL-6、TNF-α和IL-1β水平，具有优异的抗炎性能。

图3：纳米粒子的细胞胞吞和体外抗炎作用。（A）每个细胞的平均荧光强度（胞吞量）和（B）具有荧光的细胞所占的比例（胞吞率）与时间的关系。（C）细胞与粒子孵育不同时间的激光共聚焦显微镜图像。粒子用荧光素（绿色）标记，细胞核用DAPI（蓝色）染色，比例尺为10 μm。（D）RAW264.7细胞内ROS生成的代表性图像和（E）相对平均荧光强度（MFI），ROS用DCFH-DA（绿色）染色，比例尺为20 μm。LPS刺激的RAW264.7细胞，经PBS、PTKNPs、游离Dex或PTKNPs@Dex处理后，细胞培养上清中（F）IL-6、（G）TNF-α和（H）IL-1β的含量。*表示p < 0.05，**表示p < 0.01，***表示p < 0.001，****表示p < 0.0001。

三、NPs的体内治疗效果

接下来将纳米粒子通过静脉注射给LPS诱导的ALI小鼠给药，24小时后，研究纳米粒子的治疗效果。结果表明载药纳米粒子PTKNPs@Dex可以显著降低小鼠死亡率，降低小鼠的肺湿/干比，降低肺泡灌洗液BALF中蛋白和乳酸脱氢酶LDH浓度，肺组织切片染色也显示PTKNPs@Dex组显著降低肺部炎症细胞浸润（图4），说明载药纳米粒子具有良好的治疗效果，且效果优于free Dex组，这对于ALI疾病的治疗具有深远意义。与其他组相比PTKNPs@Dex可以显著降低LPS刺激后肺组织中髓过氧化物酶MPO、丙二醛MDA以及ROS的含量（图5），说明PTKNPs@Dex具有优异的抗氧化、ROS抑制能力，可以减少炎症肺组织中性粒细胞的浸润，降低组织的氧化损伤。将小鼠的肺部取出，收集肺泡灌洗液（BALF），可以发现PTKNPs@Dex可以显著降低BALF中炎症细胞尤其是中性粒细胞的浸润，显著降低促炎因子IL-6、TNF-α、IL-1β的水平（图6），说明该粒子体内抑制炎症效果明显。此外，PTKNPs@Dex可以最大程度地减少肺组织的细胞凋亡，具有抑制细胞凋亡的功能。

图4：PTKNPs@Dex减轻LPS诱导的ALI小鼠的肺损伤。（A）体内实验流程图。小鼠气管内滴注LPS建立ALI模型。两小时后，静脉注射给药。对于治疗效果分析，LPS用量为5 mg/kg，24小时后处死小鼠（上图）；对于生存率研究，LPS用量为50 mg/kg，每24小时观察小鼠生存情况，连续监测7天（下图）。（B）小鼠存活率，每组12-18只小鼠。（C）肺W/D比。BALF中（D）总蛋白和（E）LDH水平。每组5只小鼠。（F）具有代表性的肺组织HE染色切片，第二行为第一行箭头所指位置处的放大图像，原图和放大图像的比例尺分别为100 μm和50 μm。（G）肺损伤评分，每组3-5只小鼠。*表示p < 0.05、**表示p < 0.01、***表示p < 0.001、****表示p < 0.0001

图5：PTKNPs@Dex降低LPS诱导的ALI小鼠的氧化损伤和ROS水平。（A）肺组织MPO抗体染色切片的代表性图像，第二行为第一行箭头所指位置处的放大图像。蓝色为细胞核，棕色为MPO阳性细胞，第一行和第二行图像的比例尺分别为100 μm和40 μm。（B）MPO切片定量分析数据，每组3-5只小鼠。（C）肺组织匀浆MDA含量，每组5只小鼠。（D）肺组织荧光切片代表性图像（DAPI（蓝色，细胞核），DHE（红色，ROS），比例尺为100 μm）及（E）定量分析数据，每组4只小鼠。*表示p < 0.05、**表示p < 0.01、***表示p < 0.001、表示****p < 0.0001。

图6：PTKNPs@Dex对LPS诱导的ALI小鼠的炎症抑制作用。BALF中（A）总细胞、（B）中性粒细胞和（C）巨噬细胞的数量。（D）BALF中IL-6、（E）TNF-α和（F）IL-1β含量。5只小鼠/组。（G）肺组织Tunel染色代表性图像（DAPI（蓝色，细胞核）；Tunel反应溶液（绿色，凋亡细胞）；比例尺为50 μm）及（H）定量分析。3-5只小鼠/组。*表示p < 0.05，**表示p < 0.01，***表示p < 0.001，****表示p < 0.0001，ns表示在p < 0.05时没有显著性差异。

四、NPs炎症抑制机理研究

为了进一步探究PTKNPs@Dex在分子水平上的治疗机理，采用转录组基因测序技术（RNA-Seq）对肺组织进行全转录分析，比较不同处理组别之间的基因表达水平差异。发现PTKNPs@Dex主要通过调节免疫和炎症相关通路，降低一氧化氮的合成、抑制趋化因子和细胞因子的产生、减少白细胞的募集，从而降低小鼠肺部炎症和组织损伤，发挥优异治疗效果（图7）。

图7：从转录组水平研究PTKNPs@Dex降低LPS诱导的ALI炎症的机理。ALI/PBS（与健康组）、PTKNPs@Dex（与ALI/PBS组）和PTKNPs@Dex（与游离Dex组）（A）DEGs交集的维恩图，共选出48个DEGs。48个DEGs的（B）热图及（C）KEGG通路分析。互作强度最高的前10关键基因的（D）PPI网络分析（暖色节点表示有更高程度的连通性）及（E）GO和（F）KEGG通路富集。

02

论文第一/通讯作者简介

第一作者：翟梓合

浙江大学高分子科学与工程学系，生物医用大分子研究所，2020级博士研究生，研究方向为刺激响应微纳米粒子的制备及其对炎症性疾病的治疗研究。

第一作者：欧阳微

浙江大学医学院附属第二医院感染性疾病科主治医师，研究方向为肺部感染和肺损伤的致病分子机制，近年来在Am J Respir Cell Mol Biol、Cell Prolif 、J Infect Dis、J Cell Mol Med、Redox Biol等杂志发表多篇论文。

通讯作者：高长有

浙江大学高分子科学与工程学系教授，博士生导师，国家杰出青年科学基金获得者，教育部长江学者特聘教授，浙江大学求是特聘教授，国际生物材料学会Fellow，美国医学与生物工程院Fellow，Biomaterials Advances副主编。主要从事组织修复与再生材料研究，及其在心肌梗死、神经（中枢、周围）缺损、软骨/骨缺损、皮肤缺损、角膜缺损、关节炎、肺炎等疾病治疗中的应用研究。近年侧重在组织微环境响应性、自适应性组织再生材料、炎症调控材料、梯度材料调控细胞迁移和分化研究。

课题组主页：http://tac.polymer.zju.edu.cn/biomaterials/

通讯作者：徐峰

浙江大学医学院附属第二医院感染性疾病科副主任（主持工作），教授，主任医师，博士生导师，浙江大学求是特聘教授，入选教育部新世纪优秀人才计划、浙江省卫生高层次创新人才。主要从事肺部感染/肺损伤的致病机制和防治研究。近年来以通讯作者在ACS Nano、Nano Today、Biomaterials、Chemical Engineering journal、Cell Report、Redox Biology、Am J Respir Cell Mol Biol、Cell Prolif 等期刊发表论文50余篇。先后承担了6项国家自然科学基金，1项军队后勤保障部重点项目以及10余项省部级课题。

03

资助信息

该研究获浙江省自然科学基金(LD21E030001)、国家自然科学基金(51873188，81770008)、中央高校基本科研经费项目(2020XZZX004-01)的支持。

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原文信息

Zihe Zhai, Wei Ouyang, Yuejun Yao, Yuqi Zhang, Haolan Zhang, Feng Xu*, Changyou Gao*. 

Dexamethasone-loaded ROS-responsive poly(thioketal) nanoparticles suppress inflammation and oxidative stress of acute lung injury. 

Bioactive Materials, 14 (2022) 430–442.

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Bioactive Materials是一本高质量英文期刊，目前已经被SCIE、PubMed Central、Scopus、Embase收录。同时本刊还入选了2019年中国科技期刊卓越行动计划--“高起点新刊”项目。

2022年Bioactive Materials 获得影响因子16.874 ，在Materials Science，Biomaterials领域排名第一。

位于《2021年中国科学院文献情报中心期刊分区表》1区，TOP期刊。

CiteScore 2021: 14.3。