为了控制毛细血管出血，外科医生使用可吸收的止血材料止血。由于它们吸收缓慢，因此会对组织修复产生负面影响。为了避免并发症并获得促进组织修复的止血剂，Ponsen等开发了一种用后即弃的 富含 锌的海藻酸钙止血材料：HEMO-IONIC®。研究结果表明，在手术结束时使用HEMO-IONIC® 10分钟后再去除，对组织修复的所有阶段都有长期的积极影响。
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研究内容简介
引言 在手术干预结束时实现良好的止血，特别是通过控制毛细血管出血引起的渗血，是一个主要问题。为了控制毛细血管出血，外科医生使用可吸收止血材料，其中最常用的是 Surgicel®（氧化再生纤维素，强生公司）和 TachoSil®（人体纤维蛋白原和人体凝血酶涂在马胶原蛋白海绵上，武田）。Surgicel 和 TachoSil 通过提供血小板聚集框架来机械地影响止血；TachoSil 还具有生物作用，因为它可以促进纤维蛋白的形成。大量研究证明了这些产品的止血功效。尽管这种公认的疗效，已经在一些出版物中被报道。但因为它们存在于原位和缓慢的吸收，仍然存在术后并发症：组织坏死、超敏反应、过敏、狭窄、血栓栓塞并发症、败血症。此外，很少有研究评估止血剂对组织修复机制的影响。事实上，由于这些止血材料留在原地，并且由于它们的缓慢吸收（从几周到几个月），它们可能会引起异物反应并干扰切除器官的修复。这可能是一个问题，因为众所周知术后器官修复的速度对患者的康复有直接影响。因此，确保所使用的任何止血材料对新组织的形成都不会有害，且最好是促进新组织的形成，这似乎很重要。
本研究旨在比较 Surgicel 和 TachoSil 与 HEMO-IONIC® 对组织修复的影响，HEMO-IONIC®是一种由富含 Zn 2+ 的海藻酸钙组成的新型不可吸收止血材料。海藻酸钙的止血特性已被广泛认可，其刺激伤口愈合的能力已被多项基础研究和临床研究证明。与血液和渗出液接触后，钙离子被藻酸盐中释放出来，然后它们作为细胞外刺激物和细胞内信号来激活血小板和组织修复所需的细胞。Zn 2+ 是另一种触发细胞内钙信号的细胞外刺激物，可增强海藻酸钙诱导的止血和愈合。
HEMO-IONIC®与血液接触后发生离子交换，将钙离子和锌离子与血液中的钠离子交换。释放的钙（凝血因子 IV）和锌离子确保在伤口中形成持久的血凝块。同时，不溶性海藻酸钙转化为海藻酸钠水凝胶，易于从凝块中去除而不会造成新的创伤。因此，由于其生物活性（离子交换），HEMO-IONIC®可以从手术部位移除，而不会引发再次出血。除了广泛证明的海藻酸钙的愈合特性，从手术部位去除富含Zn 2+ 的海藻酸钙这一事实也应该可以通过消除异物反应的风险来促进切除器官的修复。使用 Surgicel 和 TachoSil 已观察到此类反应，由于它们保持在原位。事实上，Surgicel 和 TachoSil 可作为血小板在其中聚集的框架，它们的去除会去除新形成的血凝块，从而导致再次出血。
内皮细胞位于血液和组织之间的界面。它们是血管系统的关键组成部分，参与止血和组织修复的所有阶段。它们的核心作用已在皮肤、肝脏、肺、胰腺 和心脏，以及其他组织中得到认可。在炎症阶段，内皮细胞调节免疫细胞（如巨噬细胞）迁移到组织中。内皮细胞还通过形成新血管来确保肉芽组织的发育，新血管运输氧气和营养物质，特别是对参与细胞外基质重建和成熟的成纤维细胞。
内皮细胞可以衍生自多种干细胞和祖细胞。在本研究中，我们使用源自人脐带血循环内皮祖细胞 (EPCs) 的内皮细胞。EPC 在培养中产生内皮集落形成细胞 (ECFCs)，它们显示出有趣的特征。首先，与具有专门组织特异性特征的更成熟的内皮细胞相比，ECFCs 不是特异性的，而是代表通用内皮细胞，并已被证明能够在体内进行新血管生成。其次，这些细胞在培养中非常活跃和稳定；它们可以在不损失功能的情况下扩增，从而限制了实验间的可变性。第三，这些细胞很容易获得。
作为本组织修复研究的初步实验，使用HEMO-IONIC®、Surgicel 和 TachoSil在体外和体内实验中比较了血栓的止血效果和稳定性。然后在体外对内皮细胞评估 Surgicel、TachoSil 和 HEMO-IONIC®对细胞活化的影响。最后，在小鼠皮肤切除模型中体内评估了三种止血材料对组织修复的影响。
2. 材料与方法 2.1. 止血剂 Surgicel 是一种由氧化再生纤维素组成的针织敷布（Johnson and Johnson, Somerville, NJ, USA）。TachoSil 是一种人类纤维蛋白原/凝血酶包被的马胶原贴片（Takeda，Osaka，Japan）。Surgicel 和 TachoSil 产品说明书说它们是可吸收材料，只有多余的 Surgicel应该被移除。HEMO-IONIC 是一种通过喷涂富含葡萄糖酸锌的无纺海藻酸钙敷布（图1A）。海藻酸盐是由L-古洛糖醛酸 (G) 和D-甘露糖醛酸（M）两个单体组成的多糖。这两种单体的比例和分布决定了海藻酸盐的理化性质。具有高古洛糖醛酸水平的海藻酸钙的敷料保持其基本结构，因此是不可吸收的材料，应从病灶中去除。将海藻酸钠/叶绿酸铜 (E141) 溶液通过模具在氯化钙浴中挤出后，获得了构成 HEMO-IONIC 的主要古洛糖酸海藻酸钙纤维。将产生的纤维梳理，然后进行针刺以获得海藻酸钙敷布。然后通过喷雾使这些敷布富含葡萄糖酸锌。HEMO-IONIC 是Laboratoires BROTHIER（法国，南泰尔）正在开发的产品。
2.2. 从人脐带血中分离出内皮集落形成细胞 (ECFC) 脐带血 (CB) 样本取自圣路易斯医院（法国巴黎；ANSM 授权 PPC51）的脐带血库。在获得母亲的知情同意后，从健康足月新生儿的脐带中采集样本。在 Ficoll 梯度 (PAN-Biotech, Dutscher) 上离心脐带血后收集 CB 单核细胞 (CBMC)。然后播种 CBMC 在涂有 50 μg/mL I 型鼠尾胶原蛋白 (Corning, Boulogne-Billancourt) 并含有 EGM-2-MV 培养基 (Lonza, Basel, Switzerland) 的 12 孔板中，每孔20x10 6 细胞。涂层促进了 CBMC 中内皮祖细胞的粘附。每天更新培养基，持续 7 天，然后每两天更新一次，直到出现 ECFC 集落。然后根据 Chevalier 等人描述的方案培养 ECFC。它们被用于第3段和第5段之间的实验。
2.3. 条件培养基的制备 为了避免将止血敷布直接应用于细胞培养物而导致乏氧效应，根据标准 ISO 10993-12:2012 中提出的方案，使用条件培养基 (CM) 研究了三种止血敷布对内皮细胞的影响。CM 在 EGM-2-MV 培养基（或补充有 0.2% FBS 用于趋化迁移测定的 EBM-2 基础培养基）中制备。将每种止血敷布的片段 (1 cm 2 ) 在 2 mL 培养基中孵育 10 分钟。CM通过0.45μm孔径过滤器过滤，以去除止血敷布脱落的任何纤维。对于 Neutralized Surgicel CM，通过添加 1 M NaOH 将其pH 调节至7。
2.4. 钙和锌离子的释放 为了确定 HEMO-IONIC 在与溶液中的钠离子交换后释放的钙和锌离子的量，通过高频诱导原子发射等离子体光谱法测量溶液中的 Ca 2+ 和 Zn 2+ 浓度，根据符合 ISO 11885:2007 标准（Flandres-Analyses，Cappelle la Grande，法国）。在加入 HEMO-IONIC (1 cm 2 /2 mL) 后 0 分钟、2 分钟、5 分钟、10 分钟、30 分钟、24 小时和 48 小时，或在对照培养基中测量 EGM-2-MV 培养基中的离子浓度。
2.5. ECFC 中的Ca 2+ 信号 使用 FURA-2-AM（一种测量细胞内钙的荧光指示剂）在 ECFC 中监测细胞质Ca 2+ 浓度。在 EGM-2-MV 中， ECFC 以 10x10 3 个细胞/cm 2 的密度接种在玻璃盖玻片上。48 小时后，将盖玻片置于成像介质中（NaCl 115.5 mM；KCL 5.6 mM；MgCl 2 1.2 mM；NaH 2 PO 4 1.2 mM；NaHCO 3 5 M；CaCl 2 1.8 mM；HEPES 20 M；葡萄糖 5.5 mM）用 3 μM FURA-2-AM 分子探针在室温下避光孵育 30 分钟。洗涤后，将盖玻片置于永久助焊剂下，与 EGM-2-MV 接触，EGM-2-MV 被切换到 HEMO-IONIC CM。最大胞浆内钙通过将细胞暴露于 2μM 离子霉素（Ca 2+ 离子载体）来测量Ca 2+ 信号，并通过与 20 mM EGTA（Ca 2+ 螯合剂）一起孵育来测量最小值。使用超灵敏的 EM-CDD 相机 (Hamamatsu) 每 3 秒在两个激发波长（340 nm 和 380 nm）下测量 FURA-2-AM 探针的荧光强度 (F)。根据以下等式，对每次分析的每个细胞计算荧光比 (R) F340/F380 并用于确定细胞质 Ca 2+ 浓度：
2.6. 细胞活力 为了评估止血敷布对 ECFC 活力的影响，将细胞在对照 EGM-2-MV 培养基和 Surgicel、TachoSil 和 HEMO-IONIC CM 中孵育 45 分钟。为了确定死亡率水平，ECFCs 用膜联蛋白V/碘化丙啶 (PI) (MBL International Corporation, Clinisciences, France) 染色。使用Accuri C6流式细胞仪（BD Biosciences）对死细胞（Annexin V和PI阳性）和活细胞（Annexin V和PI阴性）的数量进行量化。
2.7. ECFC表型 为了评估三种止血敷布暴露于 CM 后内皮标记物的存在，使用对已知标记物（及其同种型对照 - Beckman Coulter）特异的荧光抗体在 4 °C 下标记 ECFC 30 分钟：抗 CD31- FITC（clone WM59，BD Biosciences）、抗 CD144-PE（clone 55-7H1，Beckman Coulter，Villepinte，法国）和抗 CD309-APC（clone 89106，R&D Systems，法国里尔）。在 Accuri C6 流式细胞仪 (BD Biosciences) 上检测和分析抗体标记的 ECFC 的荧光强度。
2.8. ECFC对炎症状况的反应 ECFC 与对照培养基或用三种止血敷布制备的 CM 接触培养 48 小时。通过添加 10 ng/mL TNF-α (Bio-techne, Lille, France) 诱导促炎环境。16h后，ICAM-1和VCAM-1在ECFC表面表达使用荧光抗体ICAM-1- FITC (1:50，Ozyme, Saint Quentin en Yvelines，法国)和抗体VCAM-1-PE (1:20，Ozyme) 进行检测，并与它们的阴性组进行对照(Beckman Coulter)。将细胞和抗体在 4°C 下孵育 30 分钟。在 Accuri C6 流式细胞仪 (BD Biosciences) 上采集和分析数据。
2.9. 增殖试验 将ECFC以5x10 3 个细胞/cm 2 接种在EGM-2-MV培养基中过夜。将细胞在含有 0.5 μM 细胞可渗透荧光染料羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯 (CFSE) 的 PBS 中孵育 15 分钟（Vybrant® CFDA SE Cell Tracer Kit – ref. V12883, Invitrogen – Thermo Fisher Scientific）。然后将 ECFC 与对照培养基或用三种止血敷布制备的 CM 接触进一步培养 48 小时、72 小时或 96 小时。使用 Accuri C6 流式细胞仪 (BD Biosciences) 记录 ECFC 中的荧光强度 (I) 随着它们的分裂而降低。平均细胞分裂次数使用以下公式计算：
2.10. 代谢活动测试 基于MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium salt; Promega, Charbonni`eres-les-Bains, 法国） 的降解，通过测量 ECFC 中存在的线粒体酶活性来量化代谢活性。产生的有色甲臜衍生物被排出到培养基中。 ECFC 以 5x10 3 个细胞/cm 2 接种在 96 孔板中，并在对照培养基或用三种止血敷布制备的CM 中培养。0 h、48 h、72 h 和 96 h 后，用 MTS 溶液（170 μL RPMI-1640 + FBS 10%，每孔 30 μL MTS）替换培养基，并在 37 °C 下孵育细胞 2 h。收获含有甲臜的溶液，洗涤 ECFC，并添加新鲜的对照培养基或 CM，直到下一个时间点。通过分光光度法在 490 nm (Multiskan Ex, Thermo Fisher Scientific, Villebon sur Yvette, 法国) 分析收获的含有甲臜的溶液。从 490 nm 吸光度测量值中减去 630 nm 的参考吸光度测量值以消除背景。
2.11. 趋化迁移试验 使用 Boyden 室在 24 孔板中评估 ECFC 的定向迁移，该室由两个重叠的隔室组成，由具有 8-μm 孔的聚碳酸酯膜隔开（BD Biosciences）。膜在室温下用 20 μg/mL 纤连蛋白 (Sigma) 孵育过夜，以促进 ECFC 粘附，并用补充有 0.2% FBS 的 EBM-2 再水化。将ECFC（2x10 5 个细胞）接种在每个上部隔室中，悬浮在补充有 0.2% FBS（对照培养基）的 EBM-2 中。
将对照培养基和止血敷布的三种 CM 添加到下部隔室中。培养基中添加了 50 ng/mL VEGF（Miltenyi，Paris，France）（一种内皮细胞的强化学引诱剂）和 50 μM 维拉帕米（一种特定的钙拮抗剂）。允许 ECFC 在 37°C 下通过膜迁移 5 小时。然后将细胞在 4% 多聚甲醛 (PFA) 中固定 10 分钟，并使用 Blue RAL 555 (RAL Diagnostics, MCL, Nemours, France) 染色。用棉签从膜的上部去除未迁移的细胞。将膜安装在 50% Glycergel® (Agilent Technologies, Les Ulis, France) 中盖玻片下的载玻片上，并在 NIKON 显微镜下观察。一式三份分析每种情况并记录3张图像/膜。
2.12. 总 ECFC 裂解物 将 ECFC 接种在 6 孔培养板中，并在 EGM-2-MV 中生长至约 90% 的汇合度。 用 1X PBS 洗涤后，将细胞在补充有 0.2% FBS 的 EBM-2 中孵育过夜。 然后将 ECFC 在补充有 0.2% FBS 的 EBM-2、补充有 0.2% FBS + VEGF (50 ng/ml) 的 EBM-2 或 HÉMO-IONIC CM 中在 37°C 培养 10 或 30 分钟。 细胞在 4 °C 裂解缓冲液（1% Triton X-100、20 mM Tris-HCL、137 mM NaCl、2 mM EDTA、10% 甘油、1 mM 原钒酸盐、25 mM β-甘油磷酸盐、2 mM 焦磷酸钠、1 mM PMSF 和完整的蛋白酶抑制剂混合物（Roche Diagnostics，Meylan，France），pH 7.4）。 通过离心（14,000× g在 4 °C 下 15 分钟）澄清裂解物。
2.13 . 蛋白质印迹分析 通过 Micro-BCA 蛋白质测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Illkirch，France）对蛋白质进行定量。 在加载和迁移到 SDS-聚丙烯酰胺凝胶之前，将等量的蛋白质 (30 μg) 与含有 50 mM 二硫苏糖醇的 Laemmli 缓冲液 2X 混合。 在电泳转移系统（iBLOT2，Thermo Fisher Scientific，Illkirch，France）中将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上 4 分钟。 立即用 3% BSA 在 TBS-T (TBS/0.2% Tween 20) 中封闭膜 1 小时。 随后用针对 Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (Cell Signaling, 1/1000) 的抗体或 hFAB™ 罗丹明抗 GAPDH 抗体 (Bio-Rad, 1/8000) 检测印迹室温下90分钟，或使用针对 p44/42 MAPK (Erk1/2) (L34F12) (Cell Signaling, 1/1000) 的抗体在 4 °C 下过夜。 对于未标记的抗体，分别使用适当的 DyLight 700 和 800 偶联二抗（Bio-Rad，1/5000）。 洗涤膜并使用 ChemiDoc MP 成像系统 (Bio-Rad) 检测抗体标记。
2.14 . 动物 所有实验程序均按照欧盟理事会关于实验动物护理和使用的指令 (2010/63/UE) 进行。经国家动物实验伦理委员会（CEEA N°26；项目 2015102910287890_v2 和 2016052316207908_v2）批准后，法国教育、高等教育和研究部批准了小鼠程序。猪的程序由动物实验伦理委员会 n°055 进行伦理评估，并获得高等教育、研究和创新部的好评（项目 n°2021030517174457）。
2.15. 肝脏病变模型 对于每种止血剂（Surgicel、TachoSil、HEMO-IONIC）和对照纱布，6 只雄性小鼠（8 周龄 C57BL/6Rj）通过吸入用异氟醚麻醉。 在皮下施用止痛药（丁丙诺啡 0.05 mg/kg）后，将小鼠腹部的皮肤剃毛并用 70% 乙醇和 Betadine® 清洁，然后进行腹部皮肤切除。 然后使用直径为 4 毫米的活检打孔器损伤肝左叶，并将四种产品（对照纱布、HEMO-IONIC、Surgicel、TachoSil）应用于出血病灶。 10 分钟后，当在所有条件下均实现止血时，移除纱布或止血剂，并记录任何再出血并使用棉签吸收血液 1 分钟进行量化。 去除止血剂十分钟后，使用新鲜棉签评估再出血。 将浸血的棉签在 4 °C 下在 500 μl 水中孵育过夜，并通过分光光度法（Multiskan Ex，Thermo Fisher Scientific，Villebon sur Yvette，France）测定在 405 nm 处的吸光度来量化失血量。
2.16 . 皮肤切除模型 对于每种止血剂（Surgicel、TachoSil、HEMO-IONIC）和对照纱布，12 只雄性小鼠（8 周龄 C57BL/6Rj）通过吸入用异氟醚麻醉。在皮下施用止痛药（丁丙诺啡0.05mg/kg）后，将小鼠背部的皮肤剃毛并用Betadine®清洁，并在背部中部进行1 cm 2 圆形皮肤切除。在小鼠中，缺损部位主要（80%）通过收缩而不是肉芽组织的形成来填充。为了保持接近人类的病变修复过程，其主要涉及肉芽组织的形成，一种限制收缩的装置专为本研究设计并获得专利 (n°FR1654097)，用于附着在缺损边缘。用 0.9% NaCl 清洗伤口后，将四种产品敷在缺损处，10 分钟后取下纱布和 HEMO-IONIC。根据它们在手术过程中用作可吸收止血剂的方式（留在切除的部位），TachoSil 和 Surgicel 留在病变部位原位，直到对组织进行取样。手术后，将小鼠分别在单独的笼子中饲养7天、14天或2个月，在这些时间点处死它们，并收集样品（每种产品在每个时间点处死4只小鼠，即48只小鼠）。皮肤样品用 4% PFA 固定，石蜡包埋并切成 3 μm 切片。 2.17. 组 织学和免疫组织化学分析 在用 pH 6 的柠檬酸盐缓冲液进行热诱导抗原修复 (HIER) 后，使用一抗对石 蜡切片进行免疫荧 光染色： F4/80（clon Cl:A3-1，AbD Serotec，1/100），波形蛋白（克隆 D21H3， Ozyme，1/100）和 Ki67（clon SP6，Abcam，1/50），然后用适当的 Alexa Fluor™ 594 标记的二抗（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，1/1000）染色。 细胞核用 Hoechst 33342（Invitrogen，1/500）染色。 水性封片（PermaFluor，ThermoFisher Scientific）后，在 NanoZoomer 2.0-RS 数字载玻片扫描仪（日本滨松）上扫描载玻片。 使用 NDP.view2 软件（日本滨松）从扫描的载玻片中以数字方式捕获图像。 使用 ImageJ 软件 (NIH) 对每个样品的三个部分进行量化和分析。 荧光强度使用 NDP.view 软件 (Hamamatsu) 对第 7 天收集的组织切片进行苏木精-伊红-赛峰 (HES) 染色后，对病变内存在的血管数量进行量化。 为了评估细胞外基质的成熟，在 2 个月时收获的组织切片用天狼猩红 (Abcam) 染色。使用 ImageJ 软件 (NIH) 在偏振光下记录的图像上分析新生组织区域上胶原蛋白 I 和胶原蛋白 III 的水平。计算胶原蛋白 I/III 比率，比率越高，表明基质越成熟。 2. 结果 3.1 与 Surgicel 和 TachoSil 相比，HEMO-IONIC 的止血效果 HEMO-IONIC 的止血潜力在体外通过全血凝血试验进行评估，在体内通过监测猪肝脏损伤的止血情况进行评估。 获得的结果表明，在实现止血方面，HEMO-IONIC 至少与 Surgicel 和 TachoSil 一样有效（图 S1A 和 S1B）。
为了进一步阐明参与止血细胞成分的分子机制，HEMO-IONIC 对内皮素-1（ET-1，一种有效的血管收缩剂）的分泌和组织因子（TF，外在途径的引发剂）表达的影响。与 HEMO-IONIC CM 接触后，内皮细胞中的 ET-1 和 TF 均显着增加（图 S1C 和 S1D）。最后，使用来自接受肝素治疗的患者的血浆在体外评估了在海藻酸钙材料中添加 Zn 2+的益处。与不含 Zn 2+的海藻酸钙材料相比，暴露于 HEMO-IONIC 显着缩短了凝血时间（图 S1E）。
3.2. 去除止血剂后的止血稳定性 在小鼠肝脏损伤上评估去除止血剂后新形成的凝块的稳定性。纱布、Surgicel 和 TachoSil 在尝试移除时明显粘在伤口上。相比之下，HEMO-IONIC 很容易被一块一块地去除而没有明显的粘连。移除纱布、Surgicel 和 TachoSil 后伤口再次开始流血，而移除 HEMO-IONIC 后止血似乎稳定。在去除止血剂后 1 分钟和 10 分钟对失血量进行量化（图 1B）。与纱布相比，使用 Surgicel 和 Tachosil 的失血量显着减少。用 HEMO-IONIC 去除材料后的失血量接近于零，并且明显低于去除纱布、Surgicel 或 TachoSil 后的失血量（图 1B）。这些结果表明 HEMO-IONIC 易于去除，并且新形成的凝块在去除后得以保留。相比之下，可吸收止血剂 Surgicel 和 TachoSil 更难去除，并且它们的去除导致再次出血。
3.3. HEMO-IONIC的钙和锌离子释放 HEMO-IONIC 的生物活性依赖于其钙离子和锌离子与血液/渗出液或细胞培养基中的钠离子交换。对照培养基中的基础 Ca 2+ 浓度为 1.86 mM。与 HEMO-IONIC 一起孵育后，该浓度随时间逐渐增加：2 分钟内增长非常迅速，然后更温和地增长直到 30 分钟（[Ca 2+ ] t=2 min = 3.66 mM；[Ca 2+ ] t=30 min = 4.33 mM）。Ca 2+ 浓度在 48 小时达到平台期（[Ca 2+ ] t=48h = 4.91 mM）（图2A ）。
与 HEMO-IONIC 一起孵育后，培养基中的 Zn 2+ 浓度也增加，从对照培养基中的 2.37 μM 增加到 2 分钟时的 23.88 μM。此后浓度稳定（图2B）。 这些结果表明，当 HEMO-IONIC 材料与含有钠离子的介质接触时，它会迅速释放其钙离子和锌离子。
3.4. HEMO-IONIC 激活 ECFC 中的Ca 2+ 信号传导 Ca 2+ 和 Zn 2+ 都是能够诱导细胞内钙信号的细胞外激活剂。基于细胞内钙信号传导，评估从 HEMO-IONIC 释放钙和锌离子对激活 ECFC 的影响。
在EGM-2-MV培养基中记录基础F340/F380比值。当细胞暴露于 HEMO-IONIC CM 时，该比率增加。在添加离子霉素后测量最大比率，随后通过添加 EGTA 将该比率恢复到基础水平（图2C ）。 ECFC中的基础细胞质Ca 2+ 浓度为75.7 nM（在EGM-2-MV培养基中）。暴露于 HEMO-IONIC CM 后，该浓度显着增加至 859.6 nM（p < 0.0001）（图 2 D）。
根据文献，500-1000 nM 的细胞质 Ca 2+ 浓度足以诱导细胞活化。因此，在周围溶液中的钙、锌离子与钠离子交换过程中，HEMO-IONIC 会释放出足够水平的离子来诱导钙信号传导和细胞活化。
3.5. 止血剂对 ECFC 活力和维持其内皮表型的影响 与对照培养基接触后，ECFC 的存活率为 91.7%，接触 TachoSil CM 后为 90.2%，接触 HEMO-IONIC CM 后为 91.5%。使用 Surgicel CM，只有 4.8% 的细胞保持活力（图 3A）。Surgicel CM 的这种剧烈作用可以通过其酸性 pH (pH = 5) 来解释，这与细胞活力不相容。为了让我们能够用 Surgicel 进行进一步的体外实验，将其 CM 的 pH 提高到 7（Neutralized Surgicel CM）。使用 Neutralized Surgicel CM，细胞活力为 89.8%（图 3A）。
ECFCs 的内皮表型基于内皮谱系表面标志物（CD31、CD144 和 CD309）的存在进行验证。在与 Neutralized Surgicel、TachoSil 和 HEMO-IONIC CM 接触后，ECFC 表达的主要内皮标志物水平与对照细胞所测得的水平相似（图 3 B）。因此，暴露于三种止血剂均可维持内皮表型。
3.6. 止血剂对 ECFC 对炎症反应的影响 在炎症期，内皮细胞在其表面表达粘附分子，例如 ICAM-1 和 VCAM-1。这些分子允许免疫细胞束缚在内皮表面并穿越血管壁。在非炎症条件下（无 TNF-α），无论使用何种培养基，ECFC 表面均未检测到 ICAM-1 或 VCAM-1 表达。在促炎条件下（使用 TNF-α），ECFC 在与用三种止血剂制备的对照培养基和 CM 接触后表达 ICAM-1 和 VCAM-1。使用 Neutralized Surgicel CM，分子的表达水平低于其他条件（图 3 C）。
基于这些结果，我们可以得出结论，用 Neutralized Surgicel、TachoSil 和 HEMO-IONIC 制备的 CM 均保留了 ECFC 对炎症状况的反应。
3.7. 止血剂对ECFCs增殖和代谢活性的影响 从 48 小时开始，相对于对照，在 Neutralized Surgicel CM 中孵育的细胞的细胞分裂次数大大减少，在 96 小时仅记录了 2 次分裂（p < 0.0001）。使用 TachoSil 和 HEMO-IONIC CM，细胞分裂的数量与对照培养基记录的数量相同，在 96 小时平均记录了 7 次分裂（图 4A ）。这些结果表明，即使在中和后，Surgicel 也能抑制ECFC 增殖，而 TachoSil 和 HEMO-IONIC 则保留了细胞的分裂能力。
在对照培养基中，代谢活性随时间线性增加（图 4 B）。使用 Neutralized Surgicel CM，未观察到代谢活性（DO Neutralized Surgicel 在 72 小时和 96 小时分别为 0.03 和 0.01，相对于对照，p < 0.0001）。在存在 TachoSil 的情况下，代谢活性相对于对照培养基逐渐降低，在 96 小时有显着差异（DO TachoSil t = 96h = 0.12；p < 0.01；图 4 B）。在 HEMO-IONIC 存在下，ECFC 的代谢活性增加，其动力学与对照培养基记录的动力学相似，直到 96 小时（DO 对照 t=96h = 0.23 vs DO HEMO-IONIC t=96h = 0.24)。这些结果表明，Surgicel 和 TachoSil 在 96 小时降低了 ECFCs 的代谢活性，并且只有 HEMO-IONIC 完全保留了 ECFCs 的代谢活性。
3.8. 止血剂对ECFCs定向迁移的影响 相对于没有 VEGF 的阴性对照，在含 VEGF 的阳性对照组中有更多的 ECFC 迁移（n 对照 -VEGF = 345 个细胞，n 对照 +VEGF = 588 个细胞；p < 0.0001；图4C ）。使用 Neutralized Surgicel 和 TachoSil，有或没有 VEGF，迁移的细胞数量与没有 VEGF 的对照的数量相似（n Neutralized Surgicel -VEGF = 275 个细胞，n Neutralized Surgicel +VEGF = 343 个细胞，n TachoSil -VEGF = 209细胞，n TachoSil +VEGF = 285 个细胞；p < 0.0001 与 n 对照 +VEGF ）。相反，即使在没有 VEGF 的情况下，HEMO-IONIC 相对于没有 VEGF 的对照组显着增加了 ECFC 迁移（n HEMO-IONIC -VEGF = 490 个细胞，p < 0.0001）。在维拉帕米（一种特定的钙摄取拮抗剂）存在下，这种不依赖 VEGF 的迁移显着降低（p < 0.05；图 4 D）。在存在 VEGF 的情况下，HEMO-IONIC 与迁移的进一步增加相关，其比例与用含 VEGF 的对照培养基观察到的比例相似（n HEMO-IONIC + VEGF = 628 个细胞；图4C ）。
这些结果表明，在没有 VEGF 的情况下，Neutralized Surgicel 和 TachoSil 的迁移与没有 VEGF 的对照培养基相似，而 HEMO-IONIC CM 具有很强的化学引诱作用，导致细胞迁移显着增加。Neutralized Surgicel CM 和 TachoSil CM 均抑制 VEGF 的化学引诱作用（细胞迁移不超过没有 VEGF 的对照组）。相反，使用 HEMO-IONIC CM，添加 VEGF 增加了 ECFC 迁移，达到与 VEGF 对照培养基相同的水平。这些结果表明，HEMO-IONIC 不仅保留了 VEGF 的作用，而且即使在它不存在的情况下也可以诱导细胞迁移。此外，不含VEGF的HEMO-IONIC 在维拉帕米存在下的迁移减少，表明 HEMO-IONIC 的迁移作用依赖于其钙离子的释放。
3.9. HEMO-IONIC 激活 ECFC 中的 ERK 信号通路 磷酸化 ERK1/2 信号通路的激活可诱导内皮细胞增殖、迁移和血管生成。蛋白印迹证明ECFCs与HEMO-IONIC CM的孵育诱导了pERK1/2的可重复瞬时表达（图4E ）。
3.10. 止血剂对组织修复的体内作用 使用小鼠皮肤切除模型评估三种止血剂对组织修复和肉芽组织形成的影响，并与纱布组进行比较。在接触四种产品（纱布、Surgicel、TachoSil、HEMO-IONIC）后，量化第 7 天愈合组织中存在的巨噬细胞、成纤维细胞和血管的数量。
3.10.1. 止血剂对巨噬细胞数量的影响 在使用 Surgicel、TachoSil 和纱布后，总巨噬细胞标记物（F4/80 受体）的平均荧光强度相似（图 5A）：伤口中浸润的巨噬细胞数量没有变化。使用 HEMO-IONIC，荧光强度相对于其他样品显着增加，相对于纱布增加 72% ，相对于Surgicel 增加73% ，相对于TachoSil增加76% (p < 0.05)。因此，在测试的三种止血剂中，只有 HEMO-IONIC 显着增加了愈合组织内存在的巨噬细胞数量。使用促炎Ⅰ型 (CD80) 和促愈合Ⅱ型 (CD206) 巨噬细胞的特异性标志物，使用 Gauze、Surgicel 和 TachoSil 在伤口中观察到巨噬细胞（图 S2）CD80 + 和 CD206 + 的比例相等。使用 HEMO-IONIC，在伤口中观察到的大多数巨噬细胞是 CD206 + 巨噬细胞。在第 14 天，不再观察到巨噬细胞数量的增加（数据未显示），进一步表明将 HEMO-IONIC 应用于伤口不会加剧炎症。
3.10.2. 止血剂对成纤维细胞数量的影响 使用 Surgicel 和 TachoSil 后成纤维细胞标记波形蛋白的平均荧光强度变化很大，与纱布记录的荧光强度没有显着差异（图 5 B）。相比之下，HEMO-IONIC 显着增加了成纤维细胞的荧光强度，与纱布相比增加了 45% (p < 0.01)。至于巨噬细胞数量，只有 HEMO-IONIC 显着增加了伤口处成纤维细胞的数量。
3.10.3. 止血剂对血管生成的影响 使用 Surgicel 和 TachoSil 后，组织切片中检测到的血管数量与纱布记录的相似（n 血管 Surgicel = 209 和 n 血管 TachoSil = 269 vs n 血管纱布 = 251 ，图 5 C）。然而，与纱布相比，所分析切片上 89% 的血管距离使用两种止血剂的部位较远。使用 HEMO-IONIC，相对于纱布、Surgicel 和 TachoSil，血管数量显着增加（n 血管 HEMO-IONIC = 482，p < 0.001）。这种增加的血管数量是短暂的，在受伤后第 14 天不再检测到（数据未显示），表明血管生成仍处于控制之下。此外，在整个伤口中观察到血管。这些结果表明只有 HEMO-IONIC 促进血管生成。
3.10.4. 止血剂对角质形成细胞的影响 使用 Surgicel 和 TachoSil 后在上皮细胞中测量的增殖标记 Ki67 的平均荧光强度与纱布条件没有显着差异（Surgicel = 12.7；TachoSil = 8.2；纱布 = 11.5；图5D ）。相比之下，与纱布相比，HEMO-IONIC 显着增加了角质形成细胞的增殖（HEMO-IONIC = 16.8；p < 0.05）。这些结果表明 HEMO-IONIC 促进上皮化。
总之，巨噬细胞、成纤维细胞、血管和角质形成细胞的组织修复实验结果表明，只有 HEMO-IONIC 可促进肉芽组织的形成和上皮化。
3.11. 止血剂对瘢痕组织细胞外基质成熟的影响 为了完成体内分析，通过分析胶原蛋白重塑，在 2 个月后在皮肤切除修复模型中评估细胞外基质的成熟度，如胶原蛋白 I/III 比率所反映的那样。使用 Surgicel 的情况下，胶原蛋白 I/III 比率与纱布记录的相似（Surgicel = 1.48 与纱布 = 1.45）。使用 TachoSil 的情况下，该比率相对于纱布 (1.30) 有所降低。HEMO-IONIC 的应用在不改变胶原蛋白 III 的量的情况下增加了 I 型胶原蛋白的量，导致 I/III 型胶原蛋白比率相对于纱布 (1.63; p < 0.0001) 以及 Surgicel 和 TachoSil 记录的显着增加(p < 0.001) (图 6 )。因此，只有 HEMO-IONIC 可加速瘢痕组织中细胞外基质的成熟。
4. 讨论 本研究的目的是比较一种新型不可吸收止血剂 HEMO-IONIC（富含 Zn 2+的海藻酸钙）、广泛使用的可吸收手术止血剂 Surgicel（氧化再生纤维素）和 TachoSil（用纤维蛋白原和凝血酶浸泡的胶原蛋白基质）。HEMO-IONIC 是一种促进愈合的止血剂，与血液接触后，通过释放钙和锌离子诱导形成稳定的凝块。随着离子的释放，HEMO-IONIC 可以从手术部位移除而不会导致再次出血，移除还有助于避免在组织愈合时对组织中存在的异物产生任何反应。Surgicel 和 TachoSil 通过机械作用，通过创建血小板聚集框架来发挥止血作用。止血后它们必须留在原位，因此可能会引发文献中所述的异物反应。这两种原位止血剂对组织修复的影响鲜有研究。在这里，我们检验了这样一个假设，即相对于 Surgicel 和 TachoSil，HEMO-IONIC 将允许更好的组织修复，从而加速患者的恢复，这不仅是因为没有异物，而且还因为它的愈合促进作用。
在比较了三种产品在体外和体内的止血效果后，我们评估了它们在体外对内皮细胞（ECFCs）活化的影响。选择这些细胞是因为它们参与了组织修复的所有阶段。最后，研究了三种止血剂对小鼠皮肤切除模型中组织修复的体内作用。
4.1. 止血 作为一项初步研究，我们验证了 HEMO-IONIC 与可吸收止血剂 Surgicel 和 TachoSil 相比的止血效果。血液凝固的体外结果表明，HEMO-IONIC 的表现明显优于 Surgicel，并且与 TachoSil 相似（图 S1A）。在体内猪肝损伤模型中，其效果与 Surgicel 相似，使用 HEMO-IONIC 在不到 5 分钟内达到止血（图 S1B）。这一结果证明了 HEMO-IONIC 的高效性，因为实验装置旨在测试在广泛出血的情况下首次使用的止血剂，即使这不是他们的适应症。相反，止血剂适用于常规技术（例如电凝）的辅助使用。根据获得的体外和体内结果，HEMO-IONIC 似乎与止血剂 Surgicel 和 TachoSil 一样有效。
在小鼠肝脏缺损处止血后，可以去除 HEMO-IONIC 而不粘连和再次出血。相比之下，Surgicel 和 Tachosil 都粘附在组织上，使其难以去除，并且它们的去除导致再次出血（图 1 B ）。大量临床研究表明，海藻酸钙可促进止血，并且与从组织中非创伤性去除相兼容 。我们的结果与已发表的研究结果一致，该研究表明与氧化再生纤维素或胶原蛋白止血剂相比，海藻酸钙可有更好的血小板聚集效果和改善的凝块稳定性。该先前研究的作者还证实，海藻酸钙的锌离子补充剂增加了血小板聚集和凝血酶的形成。
HEMO-IONIC 的止血性能可以通过其生物活性来解释：与血液接触后，HEMO-IONIC 将其钙离子和锌离子交换为循环的钠离子。钙离子作为凝血因子 IV，是导致纤维蛋白生成和凝块形成的所有酶促反应所必需的。同时，锌离子增加血小板聚集并作为酶促辅助因子有助于凝血的进程和调节。我们的结果表明，与纯海藻酸钙相比，锌离子添加剂可改善血浆凝固（图 S1E）。我们还在ECFC上体外证明，与对照条件相比，在 HEMO-IONIC 存在下内皮素-1（血管收缩剂）的分泌和组织因子（激活凝血级联的糖蛋白）的表达显着增加（图 S1C 和 S1D）。该结果表明HEMO-IONIC可以通过激活血管阶段进一步作用于体内止血。
4.2. 内皮细胞活化 根据 ISO 10993-12:2012，通过将 ECFC 暴露于其 CM并监测细胞存活、活性和迁移，在体外评估三种止血剂对内皮细胞和血管生成的影响。
这些测定的结果表明，Surgicel CM（酸性 pH 值为 5）诱导 92% 的 ECFC 死亡，而用 TachoSil 和 HEMO-IONIC 调节的培养基仅诱导 4% 的死亡。为了让我们能够对 ECFC 的内皮功能进行实验，将 Surgicel CM 中和至 pH = 7。即使在中和之后，Surgicel CM 也显着减缓了 ECFC 的增殖，降低了代谢活性，并抑制了响应于 VEGF 的迁移。这些结果证实了再生氧化纤维素的酸性 pH 值只是抑制增殖和细胞迁移的原因之一，这表明这种止血剂会释放其他具有毒性作用的物质。使用Surgicel观察到的酸性 pH 和强毒性可以解释其临床应用后报告的众多不良事件（坏死、脓肿等）。在体外，TachoSil 保留了内皮细胞的活力和增殖。然而，它显着降低了代谢活性并抑制了迁移。TachoSil 在存在或不存在 VEGF 的情况下对内皮细胞迁移的强烈负面影响可以用纤维蛋白原-E 片段来解释。纤维蛋白原是TachoSil降解的一个组成部分。根据文献，该片段具有强大的抗血管生成作用（体外和体内）并抑制内皮细胞迁移。相比之下，HEMO-IONIC 保留了 ECFC 中的活力、增殖和代谢活性，即使在没有 VEGF 的情况下，它也能诱导迁移的强烈增加，证明了它的化学引诱作用。HEMO-IONIC 诱导的迁移在维拉帕米（一种特定的钙拮抗剂）存在下显着降低，证实了 HEMO-IONIC 释放的钙离子参与其对 ECFCs 的化学引诱作用。HEMO-IONIC 还激活了 ERK1/2 通路，已知该通路通过诱导其磷酸化来诱导内皮细胞增殖、迁移和血管生成。
4.3. 组织修复 使用 ECFCs 获得的体外结果得到了对小鼠皮肤缺损的体内研究结果的证实。皮肤缺损被认为是临床伤口愈合的预测模型。在该模型中，为了与临床使用保持一致，Surgicel 和 TachoSil（可吸收）与切除部分保持接触，直到对新形成的组织进行取样；HEMO-IONIC 和对照纱布（不可吸收）在应用 10 分钟后被移除。
应用 10 分钟后的第 7 天，相对于纱布，HEMO-IONIC 是唯一一种显着增加恢复组织中巨噬细胞（大部分是促愈合 CD206 + 巨噬细胞）和成纤维细胞数量的止血剂；它还增加了血管的数量（促血管生成作用）。修复14 天后，只有 HEMO-IONIC 显着增加了角质形成细胞的增殖。
在增殖阶段，肉芽组织的形成具有以下特征：（1）成纤维细胞的迁移和增殖，这些成纤维细胞分泌新基质的产生和成熟所必需的成分；（2）新血管的形成有氧气和营养的组织。当它被移除时，HEMO-IONIC 不会干扰成纤维细胞、内皮细胞和角质形成细胞的迁移和增殖（没有留下物理屏障）。这可以部分解释在我们的小鼠皮肤缺损模型中观察到的成纤维细胞和血管数量的增加以及角质形成细胞的增殖。此外，我们的体外细胞迁移增加数据报告表明 HEMO-IONIC 可以直接激活内皮细胞。与 Surgicel 和 TachoSil 等可吸收止血剂不同，去除 HEMO-IONIC 可消除阻碍组织修复的异物反应风险。
与 Surgicel 和 TachoSil原位接触7 天后，巨噬细胞、成纤维细胞和血管的数量与纱布样品中的相似。然而，在 Surgicel 和 TachoSil 条件下，与纱布相比，血管倾向于与止血剂保持一定距离，并且不会完全定植于新生组织。该结果证实了在体外用 TachoSil 观察到的 Surgicel 的毒性作用和对内皮细胞迁移的抑制。使用这些止血剂的负面影响，与它们保持在原位的事实相关（对异物的反应和对细胞增殖和迁移的物理屏障）可能会阻碍切除器官的组织修复，从而延迟患者的恢复。
切除两个月后，用三种止血剂治疗的病灶已完全愈合。然而，用胶原蛋白 I/III 比率来量化的细胞外基质重塑，与用 HEMO-IONIC 治疗的动物与纱布处理组相比，显示显着的加速。组织成熟的特点是临时性细胞外基质（主要由纤维蛋白和胶原蛋白 III 组成）逐渐被确定性细胞外基质（主要由胶原蛋白 I 组成）取代。该研究报告称，在组织修复的早期阶段，组织内的成纤维细胞数量增多可能会促进胶原蛋白 I 和锌依赖性基质金属蛋白酶的产生，从而加速基质成熟。
将组织修复分解为三个主要的连续阶段（炎症、增殖和成熟）是人为的。实际上，这些阶段随着时间的推移部分重叠并相互作用。我们假设 HEMO-IONIC 向受伤区域释放钙和锌离子会在该过程开始时促进关键组织修复细胞（巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞……）的激活，从而为积极的连锁反应奠定基础在随后的组织修复阶段持续。
钙离子是组织修复的中心调节剂。Ca 2+ 信号是一种通用且有效的细胞活化信号，其结果是细胞质 Ca 2+ 浓度从静止时的不到 100 nM 增加到活化后的 500-1000 nM。Ca 2+ 信号调节内皮细胞的增殖和迁移，以及激活巨噬细胞、成纤维细胞和角质形成细胞。与 HEMO-IONIC 接触后，ECFC 中的细胞质 Ca 2+ 浓度增加到 860 nM，表明 HEMO-IONIC 释放了最佳水平的钙离子以诱导细胞活化。
HEMO-IONIC 释放的锌离子刺激内皮细胞（增殖、迁移）并促进血管生成。此外，Zn 2+ 作为多种蛋白质和酶的辅助因子，有助于所有修复阶段：炎症阶段的调节、细胞活化和增殖。
最后，这两种离子促进细胞外基质的重塑：钙离子通过激活成纤维细胞，锌离子通过它们作为 MMP 的辅助因子的作用。
5 . 结论 本研究分析了手术止血剂在体外对内皮细胞的影响和在体内对组织修复的影响。结果表明，HEMO-IONIC 具有与 Surgicel 和 TachoSil 相当的止血功效，且具有两个优点：它可以从手术部位移除（没有随后对异物产生反应的风险），和它促进伤口愈合（包括血管生成）后只需使用 10 分钟。鉴于藻酸盐材料的成分差异很大并且藻酸盐释放的钙离子水平取决于许多物理化学参数（海藻酸钠/海藻酸钙比例；甘露糖醛酸/古洛糖醛酸比率等），本研究的结果不能外推到其他藻酸盐。使用 Surgicel 和 TachoSil 观察到的细胞毒性提醒我们充分了解留在原位的医疗设备的影响以避免延迟组织修复的重要性。这项研究结果表明，HEMO-IONIC 在疗效、安全性和对患者的潜在益处方面是一种非常有前途的外科止血剂。此外，根据既定的定价，HEMO-IONIC（10 × 20 厘米）的估计成本与 Surgicel（2.5 × 7.5 厘米）和 TachoSil（9.5 × 4.8 厘米）相比是非常有利的。这项研究的结果提供了支持三种止血剂的比较临床研究所需的要素，以测量组织修复的速度和质量。
02
论文第一/通讯作者简介
通讯作者： Georges Uzan
French Institute of Health and Medical Research
Inserm·Unit of the Stem Cells: from their Niches to Therapeutic Applications
PhD
Docteur ès-sciences à l'Hôpital Paul Brousse (Villejuif).
Directeur de l'unité mixte de recherche Inserm 1197 - Interactions cellules souches-niches : physiologie, tumeurs et réparation tissulaire (Villejuif).
03
资助信息
我们非常感谢 Florence Armstrong 博士的科学建议和参与 AC.P. 博士研究的监督。我们还要感谢 Céline Revenu 博士在撰写本文时提供的帮助。我们感谢 Claude Boucheix 博士的科学建议和对论文的校对。我们感谢 UMS-44（前 UMS-33）提供对其众多平台的访问权限，特别是对运行 Cytometry 平台的 Denis Clay 以及动物房的整个团队的访问。我们非常感谢 Aurore Devocelle、Antonietta Messina、Nassima Benzoubir 和 Marwa Hussein 为帮助回答审稿人的问题而进行的实验所提供的帮助。最后，我们要感谢为 AC.P 提供部分资金的 Direction Générale de l'Armement (DGA)。
04
原文信息
Anne-Charlotte Ponsen, Richard Proust, Sabrina Soave, Françoise Mercier-Nomé, Isabelle Garcin, Laurent Combettes, Jean-Jacques Lataillade, Georges Uzan.
A new hemostatic agent composed of Zn2+-enriched Ca2+ alginate activates vascular endothelial cells in vitro and promotes tissue repair in vivo.
Bioactive Materials, 18, (2022) 368-382.
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Bioactive Materials SCIE、PubMed Central、Scopus、Embase
2022年Bioactive Materials 获得影响因子16.874 第一
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