氧再生支架修复临界性骨缺损|Bioactive Materials

最新的骨组织工程研究引入氧再生材料（OGM）来提供组织和植片存活所需的即时氧气。本文展示了一种具有可预测的氧释放动力学的新型产氧组织支架。该支架通过乳化的过氧化钙产氧微粒增强机械和产氧性能。体外和体内结果显示，OGM能保持稳定的代谢活性和成骨分化能力。这项研究有望在骨再生、骨替代等再生医学应用中转化。

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研究内容简介

近年来，在骨损伤修复（特别是临界性骨缺损修复）的研究中，构建同时兼具良好机械性能和可模拟骨传导、骨诱导行为的生物材料越来越得到关注。材料的仿生性能和满足临床使用场景对于骨替代物的生物材料选择至关重要。磷酸钙和羟基磷灰石等材料已经广泛用于治疗和修复颅面缺损。具体而言，磷酸钙材料具有可注射性，且在成骨过程中促进血管化；羟基磷灰石是一种存在于人体骨骼中的天然矿物，已被广泛应用于填充具有仿生和生物活性的骨替代物中。羟基磷灰石还提供了支持骨再生所需的机械强度，但限制了后期组织重塑阶段。因此，生物材料与其他生物因素相结合,模拟天然骨微环境并提高支架性能，促进骨替代物融入宿主系统是研究的重要方向。

各种生长因子已广泛应用于生物工程支架。骨形态发生蛋白（BMP）直接诱导成骨反应，血管内皮生长因子（VEGF）促进骨重建期间的血管生长。血管化过程提供了一个必要的生长网络来支持成骨、细胞活力和代谢所需的各类营养素和氧气。氧气已被证明能加速伤口愈合,并在此期间保持组织活力。因此，解决人工骨结构中供氧不足的问题，对于在体外和体内支持强健的骨再生和骨重建至关重要。

产氧生物材料（OGM）拥有这些满足骨再生的仿生特性和环境条件,其所具有的孔隙率和生物活性成分，有助于实现均匀的血管化，从而自我维持有利的成骨微环境。此外,OGM通过氧载体向损伤部位持续提供氧气。常见的氧载体，如固体过氧化物、液体过氧化物或氟碳化合物。其中固体过氧化钙在水环境中释放最高浓度的氧，它在与组织微环境中水相互作用时，逐渐水解降解，释放氧。调控水解动力学可以控制体外氧释放速率。例如，引入疏水性材料减少固体过氧化物与水环境的接触。因此，在本文中，我们引入聚己内酯（PCL）作为过氧化钙（CaO2）的疏水屏障，合成用于骨组织构建的产氧微粒。这些微粒进一步增加了明胶基水凝胶的生物性能。本文将通过大量体外和体内实验描述其生物学、化学、机械性能，展示其在细胞活力、细胞功能和骨再生过程中的优异性能。

图1:氧再生支架OGM的构建和临界性颅骨缺损修复示意图

一、氧再生支架OGM的合成

1、氧再生微粒CaO₂-PCL 的合成：于13.5%（w/v）的PCL氯仿溶液中加入不同量的CaO_2，形成PCL-CaO₂溶液，在恒定磁力搅拌下，逐滴加进PVA水相，形成CaO₂-PCL 氧再生微粒。2、氧再生支架OGM的制备：利用上诉合成的CaO₂-PCL 氧再生微粒和GelMA在UV诱导下形成OGM氧再生支架。不同成分OGM的命名见表1.

二、氧再生支架OGM的表征和体外氧动力学特征

1、本文所合成的CaO₂-PCL 氧再生微粒平均粒径100um，其在明胶GelMA支架中的浓度越高，所合成的氧再生支架OGM溶涨越少、降解越慢、机械性能越佳。

图2:氧再生支架OGM的形态学、溶涨、降解和机械性能特征。

2、在含有1mg/mL过氧化氢酶的培养基中验证OGM的产氧性能，结果显示，在无细胞的情况下，经过14天的产氧，OGM₃₀、OGM₆₀、OGM₉₀的最大氧释放分别为29%、30%和40%；而在有细胞的情况下，经过14天的成骨细胞培养，OGM₃₀、OGM₆₀、OGM₉₀的氧含量仍分别维持在为25%、28%和37%，而不含氧再生微粒的环境则表现为氧消耗殆尽。

图3:体外氧动力学实验

三、氧再生支架OGM的生物安全性

1、OGM的生物安全性验证分为五部分：首先，验证OGM支架中成骨细胞的代谢活性，结果显示OGM₆₀在14天内表现出最佳的成骨细胞代谢活性；其次，通过碱性磷酸酶ALP活性验证成骨细胞活化，结果显示：高CaO₂加载时，OGM₉₀似乎抑制了早期成骨分化，相反，OGM₆₀支架提供了最大限度的ALP活性,并表现出最强的骨诱导行为；第三，评估OMG支架中成骨细胞乳酸脱氢酶LDH活性，LDH是细胞损伤期的生物标志物，结果显示OGM₆₀支架表现出最低的LDH活性；第四，通过Caspase Glo 3/7检测OGM支架中成骨细胞的凋亡，结果仍显示OGM₆₀支架中成骨细胞凋亡最少；第五，通过检测培养14天后培养基PH仍维持在8-9，验证其安全性。

图4： OGM支架生物安全性验证

2、在体外培养的第14天，从OGM支架中分离成骨细胞，RT-PCR方法验证成骨分化，结果显示：OGM₆₀支架中成骨细胞中骨钙素（OCN）和骨形态发生蛋白7（BMP 7）表达最高，表明其促进骨分化能力最高。

图5: OGM支架促进成骨分化功能评估

四、氧再生支架OGM在体生物相容性、骨再生、组织学和免疫学验证

1、在SD大鼠颅骨制造1mm直径的圆形骨缺损，模拟临界性骨缺损模型，经过6周和12周的术后恢复，通过Micro-CT监测发现OGM支架促进骨重建效果最佳，且HE染色显示了OGM支架中成熟骨组织和纤维细胞生长的骨重建特征。

图6: OGM支架在SD大鼠颅骨缺损模型中活体骨再生和骨重建过程

2、在颅骨损伤修复过程中，OGM表现出更高的骨钙素OCN表达，TRAP染色证实了新的骨组织正在积极地进行，VEGF染色显示OGM显著改善了血管化。总体而言，体内研究表明OGM₆₀具有最大限度的TRAP和VEGF的综合再生能力。

图7: OGM支架在SD大鼠颅骨缺损模型中骨吸收、骨重建以及改善血管化作用

五、讨论和结论

氧供应对骨组织的生存和功能至关重要，尤其是临界性骨缺损修复。在这项工作中，CaO₂被组合在PCL中，以形成复合产氧微粒。这些微粒增强了GelMA在体内和体外持续提供氧气释放的时间。更重要的是，本文所描述的OGM中CaO₂逐步接触组织微环境中的水分，克服了快速水解的问题，缓慢释放氧气。其氧气的生成取决于于产氧微粒中CaO₂的量。同时，其他材料表征，例如交联密度、机械刚度和支架的孔隙率等也将影响氧释放曲线。体外结果表明：OGM₆₀支架提供最大化的细胞活力、增殖和成骨前细胞的细胞相容性。OGM支架展示了可定制的生物、化学性能和通过CaO₂负载可调节的机械性能和产氧性能。体内研究表明：在植入后12周结束时，OGM支架显著改善骨再生，Micro-CT成像揭示了大鼠颅骨再生>90%，再生骨也具有与天然骨相当的骨密度和骨厚度，同时表现出骨重建和血管化的行为。我们的工作有助于骨缺损修复、再生的临床研究和应用。

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论文第一/通讯作者简介

通讯作者：Gulden Camci-Unal

Gulden Camci-Unal, Department of Chemical Engineering, University of Massachusetts Lowell. He focuses on tissue engineeringeng, implants.

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资助信息

This research was partially supported by the American Heart Association (AHA) (19TPA34910111), the University of Massachusetts Lowell faculty start-up funds, and the National Institutes of Health (NIH) (R01DE030129).

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原文信息

Sanika Suvarnapathaki, Xinchen Wu, Tengfei Zhang, Michelle A.Nguyen, Anastasia A.Goulopoulos, Bin Wu, Gulden Camci-Unal*.

Oxygen generating scaffolds regenerate critical size bone defects.

Bioactive Materials, 13, (2022) 64-81.

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Bioactive Materials是一本高质量英文期刊，目前已经被SCIE、PubMed Central、Scopus、Embase收录。同时本刊还入选了2019年中国科技期刊卓越行动计划--“高起点新刊”项目。

2022年Bioactive Materials 获得影响因子16.874 ，在Materials Science，Biomaterials领域排名第一。

位于《2021年中国科学院文献情报中心期刊分区表》1区，TOP期刊。

CiteScore 2021: 14.3。