通过免疫-骨稳态时序性调控膜层的构建增强医用聚醚醚酮在骨质疏松条件下的骨整合性能|Bioactive Materials
近期，中国科学院深圳先进技术研究院王怀雨研究员团队在科爱出版创办的期刊Bioactive Materials上发表研究论文：该团队在医用聚醚醚酮（PEEK）表面构建可降解功能涂层。通过涂层降解过程中功能成分的顺序释放实现对免疫微环境和骨稳态的时序调控，逆转植入早期炎症反应并维持植入后期的骨稳态，最终改善PEEK在骨质疏松条件下的骨整合性能。
01
研究内容简介
医用聚醚醚酮（PEEK）因其优异的机械性能、射线透过性和良好的生物相容性等特点而被认为是一种有前景的骨科植入物的材料。值得一提的是，PEEK的弹性模量与人体皮质骨相当，可以规避困扰金属基骨科植入物的应力屏蔽效应，从而避免因应力屏蔽造成的植入物周围骨萎缩和骨坏死等问题。然而PEEK本身的生物惰性严重阻碍了其与机体骨组织之间的骨整合。
基于对骨科植入物周围骨愈合的深入了解，机体骨与植入物相互作用是一个包含不同阶段的动态过程。手术后，人工植入物周围会发生一系列生物事件，并受到多种因素的影响。在骨再生之前，宿主免疫反应在植入后数小时内启动，巨噬细胞在此早期阶段发挥核心作用。具体而言，到达植入物表面的巨噬细胞将被激活为促炎的M1表型，随后分泌少量骨愈合所需的炎症相关细胞因子。然而，如果M1表型巨噬细胞长期存在，则会引发慢性炎症，导致植入物纤维包裹，最终损害骨-植入物骨整合。相比之下，巨噬细胞从促炎的M1表型及时有效地转化为抗炎的M2表型，则不仅能通过抗炎细胞因子的分泌缓解急性炎症，而且还能释放成骨相关介质，为后续骨再生创造有利的骨免疫调节微环境。因此，PEEK植入物的表面功能化设计应充分考虑免疫调节能力。
在早期正向免疫调节之后，植入物周围骨再生过程将进入骨形成和随后的骨重塑阶段，这主要由成骨细胞和破骨细胞两种细胞协调。成骨细胞负责骨形成，而破骨细胞专门负责骨吸收。植入物周围骨再生的成功进行依赖于缺损部位骨形成和骨吸收之间的动态平衡。值得注意的是，大多数接受植入的老年患者都患有退行性疾病，特别是骨质疏松症。对于骨质疏松症患者来说，其特征是由于骨吸收过多和骨形成不足而破坏了骨稳态，导致人体骨骼的质量和数量下降。由于骨稳态失衡，骨与植入物之间的骨整合比正常情况下更具挑战性。
受植入后骨与植入物相互作用过程中的渐进生物学事件和骨质疏松症的病理特征的启发，研究团队在PEEK植入物上构建了可降解的梯度功能涂层，即溶剂挥发法在PEEK表面形成PLGA@nHA-ALN的杂化涂层，最后通过等离子体浸没离子注入介导IL-4在涂层表面接枝。如Figure 1 所示，植入后的早期阶段，IL-4的释放能及时清除炎症并营造有利的骨免疫调节微环境。随后相当长的一段时间内，ALN和Ca2+的缓慢持续释放，既抑制了过度的骨吸收，又加强了骨形成，恢复了植入体周围的骨稳态，最终促进了骨质疏松条件下骨与植入体之间的骨整合。因此，我们制备的可降解梯度功能涂层可以实现对免疫和骨稳态的时序调控，能很好地协调骨再生的动态过程。
Figure 1. Schematic illustration of the programmed surface on PEEK which enhances bone-implant osseointegration under osteoporotic conditions by creating a favorable osteoimmunomoduatory microenvironment in the early stage and facilitating bone regeneration thereafter.
实验结果表明，在PEEK表面成功制备可降解梯度功能涂层，IL-4在7天内释放完全，ALN和Ca2+能缓慢持续释放长达98天（Figure 2）。
Figure 2. Sample fabrication and characterization: (a) Schematic illustration of sample preparation; (b) Surface morphologies observed by FE-SEM; (c-f) High-resolution C1s spectra acquired from (c) PEEK, (d) PEEK-ALN, (e) PEEK-PIII, and (f) PEEK-IL4; (g) XPS survey spectra; (h) Atomic percentages determined by XPS; (i) Static water contact angles (n = 4 per group); (j) In vitro release profile of IL-4 and ALN from PEEK-IL4 incubated in the PBS solution at 37 °C (n = 6 per group). The inset presents the release profile in first 7 days. *p < 0.05 compared to PEEK, #p < 0.05 compared to PEEK-ALN, and &p < 0.05 compared to PEEK-PIII.
体外RAW264.7细胞培养结果表明，PEEK-IL4样品组表现出最佳的调控能力，促使巨噬细胞向M2型极化，而抑制其向M1型极化，同时分泌促成骨相关细胞因子（Figure 3）。
Figure 3. Inflammatory response of RAW264.7 cells cultured on different samples: (a) Cell morphology after culturing for 24 hours; (b) Cell proliferation after culturing for 1, 3, and 5 days (n = 4 per group); (c) Heat map showing the expression of M1 markers (CCR7, CD86, and iNOS) and pro-inflammatory genes (TNF-α, IL-6, and IL-1β) after incubation for 3 days (n = 4 per group); (d) Heat map showing the expression of M2 markers (CD163, CD206, and Arg) and anti-inflammatory genes (IL-4 and IL-10) after incubation for 3 days (n = 4 per group); (e-f) Percentage of (e) iNOS-positive macrophages (M1 phenotype) and (f) CD206-positive macrophages (M2 phenotype) after incubation for 3 days (n = 3 per group); (g) Expression of osteogenic-related genes (PDGF-BB, TGF-β1, and BMP-2) after incubation for 3 days (n = 4 per group); (h-j) Secretion of (h) TNF-α, (i) IL-10, and (j) TGF-β1 after incubation for 3 days (n = 4 per group); (i) Heat map showing the expression of autophagy-related genes (ATG5, ATG7, LC3B, Beclin1, and P62) after incubation for 3 days (n = 4 per group). *p < 0.05 compared to PEEK, #p < 0.05 compared to PEEK-ALN, &p < 0.05 compared to PEEK-PIII.
体外条件培养结果表明，PEEK-IL4样品组的RAW264.7条件培养基表现出最佳的骨免疫调节能力（Figure 4）。
Figure 4. Osteogenic differentiation of op-BMSCs in the conditioned medium: (a) Experimental design of the conditioned culture and analysis; (b-c) ALP activity of op-BMSCs cultured in the RAW264.7 (+) or RAW264.7 (-) conditioned medium of different groups for (b) 3 and (c) 7 days (n = 3 per group); (d) Quantitative results and corresponding images of ECM mineralization of op-BMSCs cultured in the RAW264.7 (+) or RAW264.7 (-) conditioned medium of different groups for 7 days (n = 3 per group). $p < 0.05 by comparing RAW 264.7 (+) to RAW264.7 (-) in each group, *p < 0.05 compared to RAW264.7 (+) in PEEK, #p < 0.05 compared to RAW264.7 (+) in PEEK-ALN, &p < 0.05 compared to RAW264.7 (+) in PEEK-PIII.
体外骨质疏松鼠骨髓间充质干细胞（op-BMSCs）和RANKL诱导RAW264.7细胞培养结果表明PEEK-IL4样品组促进op-BMSCs成骨生成，抑制破骨生成（Figure 5）。
Figure 5. Osteogenesis of op-BMSCs and osteoclastogenesis of RANKL-induced RAW264.7 cells cultured on the different samples: (a) Morphology of op-BMSCs after culturing for 4 and 24 hours; (b) Proliferation of op-BMSCs after culturing for 1, 3 and 5 days (n = 4 per group); (c) Heat map showing the expression of osteogenesis-related genes (ALP, COL-I, OSX, and OCN) of op-BMSCs after osteogenic induction for 7 and 14 days (n = 4 per group); (d) ALP activity of op-BMSCs after osteogenic induction for 7 and 14 days (n = 3 per group); (e) Quantitative results and corresponding images of ECM mineralization of op-BMSCs after osteogenic induction for 7 and 14 days (n = 3 per group); (f) TRAP activity of RAW264.7 cells after induction by RANKL for 9 days (n = 4 per group); (g-h) Heat map showing the expression of (g) osteoclastogenesis-related genes (TRAP, CTSK, MMP9, NFATc1, and RANK) and (h) autophagy-related genes (ATG5, ATG7, LC3B, Beclin1 and P62) of RAW264.7 cells after induction by RANKL for 9 days (n = 4 per group). *p < 0.05 compared to PEEK, #p < 0.05 compared to PEEK-ALN, &p < 0.05 compared to PEEK-PIII.
体内皮下植入结果表明，PEEK-IL4样品组表现出最佳的调节植入体周围的巨噬细胞向抗炎的M2型极化的能力。最薄的纤维层包裹，说明PEEK-IL4样品组在体内表现出最弱的炎症免疫反应（Figure 6）。
Figure 6. In vivo immunomodulatory efforts: (a) H&E staining of the peri-implant tissues after subcutaneous implantation for 3 and 7 days with the fibrous layers marked by dashed lines; (b) Thickness of the fibrous layers around the implants (n = 6 per group); (c) Immunofluorescent staining of the peri-implant tissues after subcutaneous implantation for 3 and 7 days: red (iNOS, M1 marker), green (CD163, M2 marker) and blue (nuclei); (d) Ratios of iNOS-positive cells to CD163-positive cells in the peri-implant tissues (n = 6 per group). *p < 0.05 compared to PEEK, #p < 0.05 compared to PEEK-ALN.
样品植入骨质疏松鼠股骨实验结果表明，PEEK-IL4样品组能调控植入体周围的骨稳态，表现出最佳的成骨性能和骨整合能力（Figure 7）。
Figure 7. In vivo bone regeneration under osteoporotic conditions after implantation for 4 weeks: (a) Reconstructed transverse, coronal, and 3D micro-CT images; (b-e) Quantitative analysis of the micro-CT data including (b) BMD, (c) BV/TV, (d) Tb.N and (e) Tb.Sp (n = 5 per group); (f) Red fluorescent labeling of new bone formation surrounding the implants; (g) Histological observation of the peri-implant tissues after H&E staining with new bones marked by dashed lines; (h) Histological observation of the peri-implant tissues after toluidine blue staining; (i) Histological observation of the peri-implant tissues after TRAP staining. OB, old bone; NB, new bone; Yellow arrows mark the fibrous capsule; Red arrows mark the direct contact between new bone and the implants; Black arrows mark the TRAP positive cells. *p < 0.05 compared to PEEK, #p < 0.05 compared to PEEK-ALN.
综上，受植入后骨与植入物相互作用过程中的渐进生物学事件和骨质疏松症的病理特征的启发，该团队在PEEK植入物上构建的可降解梯度功能涂层，植入早期能及时地调控免疫反应，营造有利的骨免疫调节微环境，植入后期能持续不断修复骨稳态，持续的增加植入体周围的骨再生，最终改善骨质疏松条件下PEEK与骨组织之间的骨整合。这种功能时序调控的新策略在临床应用中具有巨大潜力，并且还为其他骨科植入物的设计提供了思路，特别是针对骨质疏松症患者的骨科植入物设计。
02
论文第一/通讯作者简介
第一作者：郑延延
川北医学院副教授，中国科学院深圳先进技术研究院博士后，主要从事骨科植入材料表/界面功能构建的研究。先后承担四川省科技厅重点研发项目、中国博士后科学基金面上项目，中国科学院深圳先进技术研究院优秀青年创新基金及四川省科技厅应用基础项目等多项课题，以第一作者或通讯作者在Bioactive Materials, Materials Science and Engineering C，Colloids and Surfaces B: Biointerfaces等国际期刊发表论文10余篇。
第一作者：高昂
中国科学院深圳先进技术研究院助理研究员，主要从事骨科植入材料的表面改性研究。先后承担中国博士后科学基金面上项目一等资助、国家自然科学基金青年基金、深圳市基础研究面上项目等多项课题。以第一作者身份发表SCI论文6篇，其中3篇发表在生物材料领域旗舰期刊 Biomaterials 上；以共同第一作者身份发表学术论文 2 篇，分别发表在新晋期刊 Bioactive Materials 和 Smart Materials in Medicine 上。
第一作者：柏家祥
苏州大学附属第一医院骨科博士研究生，研究生党支部书记，主要从事骨与关节疾病诊疗的基础与临床。以第一作者和共同第一作者在Biomaterials、Nature Communications、Bioactive Materials等国际期刊发表论文10余篇，任Acs Nano、Frontiers in Pharmacology等SCI期刊的审稿人。
通讯作者：王怀雨
中国科学院深圳先进技术研究院研究员，博士生导师，国家自然科学基金委优秀青年基金获得者，广东省特支计划科技创新青年拔尖人才，中国科学院青年促进会优秀会员。Plasma Based Ion Implantation & Deposition International Committee Member，Smart Materials in Medicine杂志副主编，中国生物材料学会康复器械与生物材料分会副主任委员，中国生物材料学会青年委员会委员，中国生物材料学会先进制造分会委员，中国颗粒学会青年理事。主要研究方向为生物材料，尤其是骨科植入材料的表/界面功能构建。先后承担国家自然科学基金、国家重点研发计划课题、中国科学院STS区域重点等项目。共发表SCI论文80余篇，引用7700余次；一作/通讯作者论文40余篇，其中20余篇发表在Nat. Commun., Adv. Mater., Angew. Chem. Int. Ed., The Innovation, ACS Nano, Adv. Sci., Biomaterials, Bioact. Mater.等中科院1区刊物。
通讯作者：童丽萍
中国科学院深圳先进技术研究院研究员，博士生导师，中国科学院青年促进会会员，深圳市高层次人才C类，深圳市后备人才。研究领域包括外场调控骨再生、新型功能生物材料的设计、材料表面与机体相互作用与机理研究。先后承担国自然科学基金、省级自然科学基金、深圳市科技项目、企业横向研究基金等项目。以第一/通讯作者在ACS Nano，Bioact. Mater., Bone Res., Biomaterials等期刊发表论文10多篇。
通讯作者：耿德春
苏州大学附属第一医院骨科研究员，博士生导师，江苏省杰出青年基金获得者；长期致力于骨质疏松、内植物松动等慢性骨丢失疾病相关研究，主持国家自然科学基金项目4项，以通讯作者在Autophagy、Biomaterials、Clin Transl Med、Bioactive Materials、J Bone Miner Res等国际顶级刊发表SCI论文60余篇，其中10篇论文IF>10，作为主要完成人获2021年江苏省科技进步一等奖、2017年国家科技进步二等奖、2016年华夏医学科技一等奖。
03
资助信息
该研究获 国家自然科学基金（31922040 和82001965）、深圳市科技研究基金 （SGLH20180625144002074, JCYJ20180507182637685和JCYJ20190806165616542）、中国科学院青年创新促进会 (2017416和2020353），广东省基础与应用基础研究基金（2020B1515120078），中国博士后科学基金（2019M663190），中国科学院深圳先进技术研究院优秀青年创新基金（E1G034），南充市科技计划（20SXQT0302）以及香港城市大学战略研究资助（7005505）的支持。
04
原文信息
Yanyan Zheng#, Ang Gao#, Jiaxiang Bai#, Qing Liao, Yuzheng Wu, Wei Zhang, Min Guan, Liping Tong*, Dechun Geng*, Xin Zhao, Paul K. Chu, Huaiyu Wang*.
A programmed surface on polyetheretherketone for sequentially dictating osteoimmunomodulation and bone regeneration to achieve ameliorative osseointegration under osteoporotic conditions.
Bioactive Materials, 14, (2022) 364-376.
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Bioactive Materials是一本高质量英文期刊，目前已经被SCIE、PubMed Central、Scopus、Embase收录。同时本刊还入选了2019年中国科技期刊卓越行动计划--“高起点新刊”项目。
2022年Bioactive Materials 获得影响因子16.874 ，在Materials Science，Biomaterials领域排名第一。
位于《2021年中国科学院文献情报中心期刊分区表》1区，TOP期刊。
CiteScore 2021: 14.3。