中国医学科学院&北京协和医学院刘鉴峰和中国医学科学院生物医学工程研究所王伟伟：多肽水凝胶通过巨噬细胞极化克服肿瘤放疗耐受|BAM

近期，中国医学科学院&北京协和医学院刘鉴峰研究员和中国医学科学院生物医学工程研究所王伟伟研究员在科爱出版创办的期刊Bioactive Materials上联合发表文章：基于TLR7/8激动剂键合的放疗增敏多肽水凝胶构建的肿瘤巨噬细胞极化策略用于克服肿瘤放疗耐受。从合成具有巨噬细胞极化的、具有放疗增敏性质的多肽水凝胶出发，首先系统性的研究了Smac-TLR7/8水凝胶的巨噬细胞极化效果，研究发现M0和 M2型巨噬细胞均实现了向M1极化；极化后的巨噬细胞增强了促炎因子的分泌、巨噬细胞的吞噬效果、以及放疗介导的DNA损伤效果；最后在体内通过巨噬细胞极化激活了抗肿瘤免疫应答，并下调了Treg细胞的表达，进而增强了放疗的抗肿瘤效率。为临床提供了新型的克服肿瘤放疗耐受的新思路。

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研究内容简介

放射治疗（RT）在临床上被广泛应用于实体瘤的治疗，临床上有超过50%的肿瘤患者会接受放射治疗。然而受到先天性和获得性放疗抵抗的影响，导致临床治愈率低于40%。导致放射抵抗的原因是多方面的，但与特殊的肿瘤微环境（TME）密不可分。快速增殖与缺氧是TME的特点，导致肿瘤周围长期存在慢性炎症环境，逐渐促进免疫抑制性肿瘤微环境（ITM）的形成。ITM主要由抑制性免疫细胞组成，包括肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、髓源性抑制细胞（MDSCs）和调节性T细胞（Treg细胞），以及某些炎症性趋化因子或细胞因子如IL10和TGF-β。尤其是在连续地、大剂量的放疗之后，会进一步恶化ITM，主要表现为巨噬细胞向具有免疫抑制的M2型趋化，Treg细胞上调并大量蓄积在肿瘤组织因此。因此，尝试重建ITM对提高RT疗效和克服放射耐受具有重要意义。

在此，制备了一种新型的TLR 7/8激动剂共轭放射敏感肽水凝胶Smac-TLR7/8，通过重建ITM来克服放疗抵抗。选择Smac增敏肽来提高肿瘤的放射敏感性，并与toll样受体TLR7/8的激动剂共轭，驱动巨噬细胞向M1表型极化，以重建ITM。通过Smac-TLR7/8肽水凝胶联合中等剂量的γ射线辐射处理后，TAMs可以通过激活NF-κB途径重新极化为抗肿瘤状态（M1），从而提高放疗效果。更重要的是，巨噬细胞的再极化进一步诱发了免疫反应，促进了细胞毒性T细胞的招募，减少了Treg细胞，从而通过重建ITM来克服放疗抵抗。这种新的策略为成功改善放疗和克服放射耐受带来了新的曙光，即通过极化TAMs、激活抗肿瘤免疫和下调Treg细胞重建ITM（图1）。

图1. Smac-TLR7/8水凝胶调节巨噬细胞极化、重塑ITM、克服辐射抵抗的示意图

一、Smac-TLR7/8水凝胶表征

Smac-TLR7/8水凝胶表征入图2所示，Smac-TLR7/8水凝胶在透射电镜和扫描电镜下呈现纳米纤维和多孔状结构。通过流变学分析进一步验证了Smac-TLR7/8为凝胶性质。并通过细胞毒性实验和体外溶血实验验证了Smac-TLR7/8水凝胶具有较高的生物相容性。

图2. Smac-TLR7/8水凝胶的理化、生物学表征

二、Smac-TLR7/8水凝胶的巨噬细胞极化实验

在放疗照射下（4 Gy），Smac-TLR7/8 水凝胶将原代的巨噬细胞（BMDMs）极化成M1表型，并明显的高于其他对照组（图3）。同时通过western blot分析其分泌的炎症因子，M1表型的因子（TNF-α，iNOS）得到明显上调，并下调M2表型的炎症因子（IL-10，Arginase 1）。同时基因水平的M1型炎症因子也得到明显上调。在重极化方面，Smac-TLR7/8水凝胶联合RT能够将M2表型的巨噬细胞（BMDMs）重极化成M1表型。通过激光共聚焦观察可发现重极化的BMDMs的形态由细长的、梭型结构变成多触角的、接近圆形的细胞结构，且高表达M1型标志物。通过流式分析也验证了其重极化的效果，即高表达M1型巨噬细胞标志物（CD86），低表达M2型巨噬细胞标志物（CD206）。

图3. Smac-TLR7/8 水凝胶联合放疗增强巨噬细胞体外极化。

三、极化后的巨噬细胞功能验证

如图4所示，经Smac-TLR7/8联合放疗处理的巨噬细胞明显上调了M1相关的细胞因子（TNF-α，IFN-γ），下调了M2相关的细胞因子（IL-10）。并增强了对B16癌细胞增殖的抑制。极化后的局势细胞增强了其本身的吞噬能力。最后，M1型巨噬细胞增强了放疗介导的DNA损伤效果。总的来说，巨噬细胞被调控为M1表型后，其抗肿瘤功能得到明显改善。

图4. 经Smac-TLR7/8联合放疗极化成的M1型巨噬细胞的抗肿瘤功能评估

四、体内抗肿瘤研究

在黑色素瘤小鼠模型中，验证了Smac-TLR7/8联合放疗的抗肿瘤效果。如图5所示，Smac-TLR7/8联合放疗显著地抑制了肿瘤的生长，其抑瘤效率高达86.3%。并通过切片染色分析，Smac-TLR7/8明显的抑制了肿瘤细胞的增殖，增强了肿瘤细胞的凋亡和坏死。通过免疫学分析，发现Smac-TLR7/8联合放疗后成功的将肿瘤中的M2型巨噬细胞成功的极化成M1型，并激活了抗肿瘤免疫应答，其中CD8+,CD4+ T细胞均实现了高表达。

图5. Smac-TLR7/8联合放疗的抗肿瘤研究及免疫分析

五、体内重塑ITM研究

最后，我们在两种肿瘤模型小鼠中（黑色素瘤和乳腺癌），通过联合αPD-1研究了Smac-TLR7/8联合放疗的抗肿瘤效果。如图6所示，Smac-TLR7/8联合放疗及αPD-1在两种肿瘤模型小鼠中均取得了最好的肿瘤抑制效果。重要的是，通过巨噬细胞极化（由M2向M1极化）激活抗肿瘤免疫的同时，进一步的下调了免疫调节性T细胞（Treg）的表达，由此实现了ITM的有效重塑，进而实现了最高的肿瘤抑制效率。

图6. Smac-TLR7/8联合放疗联合αPD-1的抗肿瘤研究及免疫分析

最后作者指出在TLR7/8结合的放射敏感肽水凝胶（Smac-TLR7/8水凝胶）的基础上，开发了一种通过调节巨噬细胞极化重建ITM来克服放射抵抗的有效策略。Smac-TLR7/8水凝胶通过激活NF-κB途径，成功地将巨噬细胞从促肿瘤（M2型）调节到抗肿瘤（M1型）状态，从而在体外放疗过程中进一步增强细胞毒性、吞噬作用和DNA损伤。重要的是，这种TAMs重极化的策略通过上调M1型TAMs，下调M2型TAMs，增加细胞毒性T细胞，特别是降低体内抗肿瘤治疗中Treg细胞的表达，实现了ITM的重建，从而表现出积极有效的肿瘤抑制率，克服了放疗抵抗。同时，免疫检查点抑制剂（αPD-1）与Smac-TLR7/8水凝胶联合放射治疗，进一步增加细胞毒性T细胞，减少Treg细胞。因此，纳米药物和免疫疗法的结合可能是加强ITM重建和克服放射抵抗的理想治疗手段。

02

论文第一/通讯作者简介

第一作者：张玉民

中国医学科学院放射医学研究所助理研究员，2021年于北京协和医学院取得博士学位。主要研究方向是功能性纳米药物构建。主持国自然青年基金1项及协和青年教师基金2项。以第一作者、共同一作、共同通讯发表SCI论文十余篇，主要包括Advanced Science、Bioactive Materials、Advanced Healthcare Materials、Acta Biomaterilia、ACS Applied Materials & Interfaces等。取得授权专利4项。

共同第一作者：冯祖建

中国医学科学院生物医学工程研究所助理研究员，2021年于天津大学取得博士学位。主要研究方向为多功能水凝胶皮肤敷料以及柔性电子器件的仿生设计。其相关工作以第一作者在Advanced Functional Materials、Biomaterials、 ACS Applied Materials & Interfaces、Biomaterials Science等国外TOP期刊发表。

通讯作者：王伟伟

中国医学科学院生物医学工程研究所研究员，博士生导师，获得天津市科技进步二等奖，国际先进材料协会科学家奖，天津市青年科技工作者协会优秀青年科技工作者；入选天津市青年人才托举工程，中国医学科学院青年医学人才。以通讯作者在Science Advances、Advanced Functional Materials、ACS Nano、Nano Letters、Nano Energy、等国内外TOP杂志上发表SCI论文50余篇，获得授权国家发明专利12项。

通讯作者：刘鉴峰

中国医学科学院 & 北京协和医学院研究员，博士生导师，获国家杰青、国家优青，天津市杰青等项目资助，享受国务院特殊津贴专家，天津市有突出贡献专家 。在纳米药物研发、多模态分子探针研制、放射性核素标记及药代动力学等领域开展研究。以通讯/共同通讯作者在Sci Adv、J Am Chem Soc、Angew Chem Int Ed Engl、Adv Mater等国际知名期刊上发表SCI论文80余篇，被引用4000余次。申请发明专利12项，获得授权9项。

课题组主页： http://www.liu-lab.cn/home.html

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资助信息

该研究获国家自然科学基金(81971731, 82001963)、北京协和医学院青年基金和中央高校基础研究基金（No.3332020058）、中国医学科学院非营利性中央研究院基金（2018PT35031）、天津市杰出青年学者国家科学基金（18JCJQJC47300）和中国医学科学院医学科学创新基金（2021-I2M-042）的资助。

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原文信息

Yumin Zhang^#, Zujian Feng^#, Jinjian Liu, Hui Li, Qi Su, Jiamin Zhang, Pingsheng Huang, Weiwei Wang*, Jianfeng Liu*. 

Polarization of tumor-associated macrophages by TLR7/8 conjugated radiosensitive peptide hydrogel for overcoming tumor radioresistance. 

Bioactive Materials, 16, (2022) 359-371.

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Bioactive Materials是一本高质量英文期刊，目前已经被SCIE、PubMed Central、Scopus、Embase收录。同时本刊还入选了2019年中国科技期刊卓越行动计划--“高起点新刊”项目。

2022年Bioactive Materials 获得影响因子16.874 ，在Materials Science，Biomaterials领域排名第一。

位于《2021年中国科学院文献情报中心期刊分区表》1区，TOP期刊。

CiteScore 2021: 14.3。