南方医科大学喻志强，于梦和李爱民：CXCR4靶向脂质体调节乏氧和免疫抑制微环境用于索拉非尼耐药肝癌治疗|BAM
近期，南方医科大学喻志强教授，于梦副教授和中西医结合医院李爱民教授在科爱出版创办的期刊Bioactive Materials上联合发表研究性文章：CXCR4靶向脂质体调节乏氧和免疫抑制微环境用于索拉非尼耐药肝癌治疗。本研究基于LFC131多肽修饰的饱和氧全氟己烷脂质体为核心构建氧气递送纳米平台，阻断SDF-1α/CXCR4轴和CSF1/CSF1R通路，逆转肿瘤免疫抑制，克服索拉非尼耐药。
01
研究内容简介
肿瘤缺氧是导致肿瘤治疗失败的主要原因之一，对肿瘤缺氧几乎没有有效的治疗方法，而且很多研究结果表明索拉非尼治疗效果不佳也与肿瘤逃避免疫监测的适应机制密切相关。肝癌是一种血管异常丰富的高血管肿瘤，特别是肿瘤深部组织缺氧，是实体瘤治疗失败的主要原因。作为临床一线药物，索拉非尼是一种多激酶抑制剂，通过阻断肿瘤血管生成和抑制肝癌细胞增殖在晚期肝癌治疗中发挥重要作用。出乎意料的是，索拉非尼对远端肿瘤的细胞毒性有限，因为穿透性差和肿瘤内缺氧诱导的耐药性。肿瘤缺氧可诱导细胞周期阻滞，增加蛋白质抗性，导致耐药和无效治疗。
近年来，研究人员尝试了多种策略通过减轻肿瘤缺氧提高疗效。具有代表性的是，可直接向缺氧微环境提供氧气的载氧纳米材料，以提高氧依赖性的治疗效率。其中，全氟己烷(PFH)作为一种临床人工血液替代物，因其对O2具有较高的亲和力和良好的生物相容性而被广泛应用，可输送O2以克服缺氧相关耐药。然而，纳米载体包裹的载氧PFH只能在一定程度上减轻缺氧，许多受缺氧条件限制的抗肿瘤治疗药物在治疗过程中通过持续消耗O2或上调缺氧相关蛋白的表达，导致缺氧恶化。有证据表明，索拉非尼可激活C-X-C受体4 (CXCR4)/基质源因子-1α (SDF-1α)轴，诱导HCC瘤内缺氧加重，进而导致肿瘤进展、侵袭和转移，并对抗血管生成治疗产生耐药性。为了聚焦这一药物表达途径，设计CXCR4拮抗剂LFC131识别并结合索拉非尼耐药HCC细胞表面过表达的CXCR4，LFC131多肽通过阻断SDF-1α/CXCR4轴(诱导癌细胞增殖和肿瘤促进微环境极化)使肝癌对索拉非尼致敏。因此，我们合理推测LFC131 (CXCR4抑制剂)通过靶向肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞的SDF-1α/CXCR4轴与索拉非尼协同抗肿瘤作用，同时调节缺氧微环境抑制索拉非尼耐药。
除了缺氧条件外，越来越多的证据表明，索拉非尼治疗疗效不足也与肿瘤逃避免疫监视的适应机制密切相关，包括致瘤TAMs的扩增，以及骨桥蛋白(OPN)或程序性死亡配体-1 (PD-L1)在HCC细胞上的固有表达。研究表明，OPN通过激活巨噬细胞中的集落刺激因子1 (CSF1)/CSF1受体(CSF1R)通路，促进TAMs的趋化迁移和M2样极化，进而导致免疫抑制细胞因子的增加和抗肿瘤免疫反应的阻断。已有研究在HCC治疗中使用CSF1抑制剂调节CSF1R的表达，从而阻碍TAMs的招募，调节M2表型极化，提高免疫检查点封锁治疗的疗效。针对CSF1/CSF1R信号轴的单克隆抗体或小分子抑制剂正在临床试验中使用，但由于应答率较低，疗效有限。据报道，所获得的化合物PLX3397是CSF1R酪氨酸激酶的一个竞争性和高度特异性的抑制剂，它在临床前模型中CSF1和CSF1R之间的旁分泌相互作用中发挥了关键作用。因此，结合CSF1/CSF1R途径和CXCR4抑制剂克服缺氧可能是一种潜在的治疗索拉非尼耐药的策略。
本文设计了一个多功能的氧气递送纳米平台PFH@LSLP，可以靶向肿瘤乏氧条件下高表达的CXCR4，并同时递送索拉非尼和CSF1/CSF1R抑制剂PLX3397。该脂质体基于饱和氧的全氟己烷(PFH)核脂质体，以及表面修饰的CXCR4拮抗剂LFC131多肽。PFH@LSLP是通过以下3种作用的协同效应来克服索拉非尼耐药: 1)O2饱和的PFH核心可以通过O2供应缓解肿瘤缺氧; 2) LFC131多肽靶向肿瘤乏氧过表达的CXCR4，阻断SDF-1α/CXCR4轴，使HCC细胞对索拉非尼重新敏感; 3) PLX3397通过抑制TAMs中的CSF1/CSF1R通路激活免疫应答，进一步增强CD8+ T细胞浸润，逆转肿瘤免疫抑制。在H22荷瘤小鼠和肝癌患者来源的肿瘤异种移植模型(PDX)上的抗肿瘤性能表明，PFH@LSLP可以通过协同作用缓解肿瘤缺氧、调节耐药相关基因和重塑免疫微环境来克服索拉非尼耐药（示意图1）。
示意图1. 设计开发的PFH@LSLP纳米粒通过调节缺氧和免疫抑制微环境介导的抗肿瘤协同疗法治疗索拉非尼耐药肿瘤。
首先，本文设计合成LFC131多肽可特异性结合在索拉非尼耐药HCC细胞上过表达的CXCR4，质谱(MS)和高效液相色谱(HPLC)证实了LFC131肽的成功合成。然后，基于乏氧条件下协同治疗的策略，将LFC131修饰在与化疗药物索拉非尼和CSF-1抑制剂PLX3397共载的脂质体上，实现了HCC特异性PFH@LSLP。通过动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)等对PFH@LSLP特性进行表征，结果表明PFH@LSLP可以通过持续扩散氧气来缓解缺氧环境，从而实现药物的高效释放（图1）。
图1. 纳米粒PFH@LSLP NPs的表征。(A) LS、PFH@LS、PFH@LSL、PFH@LSLP的TEM图像。比例尺:100纳米。(B) DLS测得不同纳米颗粒的形态图及尺寸分布。(C) PFH@LSLP纳米粒子在低氧和常氧条件下的药物释放行为示意图。(D)含各种纳米颗粒的缺氧溶液中的氧气供应。(E)低氧条件下LS、PFH@LS、PFH@LSL和PFH@LSLP体外释放索拉非尼。数据以平均值±SD表示(n = 3)。***p<0.001。
图2. PFH@LSLP在缺氧条件下的细胞毒性及其机制。(A) PFH@LSLP在低氧条件下培养的HepG2细胞体外抗肿瘤评价示意图。(B) MTT法测定肝癌细胞(HepG2)在37℃低氧和常氧条件下的细胞活力。(C) Annexin V-FITC和PI染色法分别在低氧和常氧条件下检测细胞凋亡。(D) PFH@LSLP在缺氧条件下通过SDF-1α/CXCR4途径克服索拉非尼耐药的示意图。(E)低氧条件下PFH@LSLP调节HIF-1α和CXCR4表达的Western blotting分析。(F) HepG2细胞与不同配方(PFH@LSLP、PFH@LSL、PFH@LS和LS)在37℃缺氧条件下孵育4 h后HIF-1α表达的免疫荧光分析。比例尺:100µm。** p < 0.01, ***p < 0.001。
进一步探讨PFH@LSLP NPs协同治疗肿瘤的潜在生物学机制，我们对暴露于不同处理组的小鼠肿瘤进行了全基因组RNA表达测序。通过RNA测序，揭示除了在PFH@LSLP中有明显差异外，各组的基因表达具有高度一致性，这被推断是由PFH@LSLP中存在的PLX3397在缺氧条件下的免疫激活引起的。利用KEGG和GO数据库分析各组的相关通路，结果表明PFH@LSLP多个信号通路受到显著影响，如信号转导，炎症反应，细胞分化和凋亡过程。相对缺氧基因在PFH@LSLP组包括DDAH1, CHRNB2, ANGPTL4, UCP3, ADORA1下调，表明PFH@LSLP缓解肿瘤乏氧微环境。总之，PFH@LSLP治疗将基于药物的细胞毒性与低氧抑制和免疫激活结合起来，构建了一个全面、高效的肿瘤治疗体系（图3）。
图3.通过RNA测序分析小鼠H22肿瘤治疗后的转录水平。(A) PBS组、LS组、PFH@LS组、PFH@LSL组、PFH@LSLP组5组的一致性分析。(B) 不同治疗组的表达基因数的VENN图。(C) 火山图分析LS、PFH@LS、PFH@LSL和PFH@LSLP与PBS组比较的差异表达基因。(D)不同处理组间差异基因表达的GO分析。(E) PBS和PFH@LSLP中凋亡、缺氧和免疫相关基因表达水平的热图。
图4. PFH@LSLP对肝癌PDX小鼠模型的体内抗肿瘤作用。(A) BABL/c裸鼠HCC PDX模型建立及给药过程示意图。(B)不同处理后的肿瘤组织数字图像(n = 5)。(C)治疗过程中小鼠肿瘤生长曲线(n = 5)。(D)治疗后14 D切除的小鼠肿瘤重量。(E)体重变异的老鼠接受不同治疗14 d。(F)的主要肿瘤生长曲线个人鼠标从每组肝癌PDX小鼠模型(n = 5)。(G)免疫荧光检测表达的肿瘤部分缺氧标记(HIF-1α和趋化因子受体CXCR4)和凋亡标记 (CD31、p53、半胱天冬酶3) 后治疗。比例尺: 200 μ m。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。
综上所述，我们构建了一种具有缺氧正常化和免疫激活功能的肿瘤特异性脂质体PFH@LSLP，用于索拉非尼耐药肿瘤治疗。首先，将PFH包埋在脂质体中作为氧库以缓解肿瘤缺氧；其次，将LFC131肽修饰在脂质体表面，赋予其肿瘤靶向能力，识别并结合HCC细胞上过表达的CXCR4，进而阻断下游SDF-1α/CXCR4通路，克服缺氧相关索拉非尼耐药；此外，CSF1/CSF1R抑制剂PLX3397的联合应用是通过增加肿瘤和淋巴结中CD8+ T细胞浸润和DC细胞的成熟，进一步激活肿瘤免疫，同时重塑致瘤免疫微环境，使之达到抑瘤状态。因此，协同化疗和免疫治疗的多功能TME调节策略大大提高了索拉非尼耐药肿瘤的治疗效果。
02
论文第一/通讯作者简介
第一作者：王月华
博士，南方医科大学博士后，研究方向为功能化纳米诊疗载体的构建和代谢免疫治疗的应用。
共同第一作者：王振杰
博士，南方医科大学博士后，主要从事新型近红外染料构建及其在肿瘤多模态治疗中的应用研究工作。
通讯作者：喻志强
博士，教授，博士生导师和博士后合作导师。南方医科大学附属东莞医院（东莞市人民医院）检验医学中心主任，兼任东莞市肿瘤临床药物研究所常务副所长。长崎大学药学博士，美国亚利桑那州立大学博士后。曾担任南方医科大学药剂学专业教授，先进生物材料PI团队主任。其课题组主要研究兴趣包括新型药物递药系统，癌症诊疗一体化，肿瘤标志物筛选和分子诊断试剂盒的研发。近年来团队以一作或者通讯在Adv. Mater, J. Am. Chem. Soc, ACS Nano, Angew. Chem. Int. Ed, Adv. Funct. Mater, Nano Lett, Adv Sci, Biomaterial, J Med Chem和J Control Release等国际期刊发表SCI论文50余篇， 其中ESI高被引论文12篇，2019年以来以通讯作者发表IF >10论文20余篇, 论文被引用次数约5200，H因子42。2015年以来主持3项目国家自然科学基金。担任Adv Mater，ACS Nano，Adv Funct Mater，Biomaterials和J Med Chem等多个主流国际杂志评审专家。广东省精准医学运用学会纳米医学分会副主任委员；广东省卫生经济学会检验经济分会副会长；广东省转化医学学会分子诊断学会副会长；中国抗癌协会纳米肿瘤学会青年委员；中国生物程委员会青年委员；中国药剂学专业委员会青年委员；Chin Chem Lett高级编委；Asian J Pharm Sci青年编委；Acta Pharmaceutica Sinica B青年编委。
通讯作者：于梦
药剂学博士，南方医科大学副教授，硕士生导师。近年来围绕智能响应药物递送体系在病灶微环境调控与治疗方面的应用，开展了一系列工作。在ACS Nano、Advanced Science、Small Methods、Nano Letters、Bioactive Materials、Biomaterials、Journal of Controlled Release、Acta Pharmaceutica Sinica B等国际期刊上发表SCI收录论文40余篇，参编论著2部，申请并授权国内专利3项，论文被国内外同行引用1400次以上，H因子为24。主持国家自然科学基金青年项目、广东省自然科学基金项目、南方医科大学高层次人才培育项目等；担任SCI杂志Asian J Pharm Sci和Chinese Chem Lett的青年编委，广东省精准医学应用学会分子影像分会常务委员。
通讯作者：李爱民
南方医科大学中西医结合医院教授，广州抗癌协会副会长、广东省医学会肿瘤学分会常委兼内科学组副组长、广州抗癌协会生物治疗专业委员会主任委员、广州抗癌协会肝胆胰肿瘤专业委员会常委、广东省抗癌协会肝胆胰肿瘤专业委员会常委。主要从事肿瘤化疗、免疫治疗、分子靶向治疗、微创介入治疗和综合治疗，尤其是肝胆胰肿瘤的微创介入治疗方面有较丰富的经验。在CANCER CELL、ONCOGENE、CANCER RESEARCH、THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY、PLOS ONE等期刊发表论文20余篇，担任Bioactive Materials的Special Issue Guest Editor，入选2020 Emerging Investigators of Journal of Materials Chemistry B。
03
资助信息
本研究得到国家自然科学基金项目(81773642、52073139)、广东省自然资源中心 (2020)037、广东省自然科学基金项目(2019A1515011619、2019A1515011498)、广东省中药研究中心研究项目(NO.20203006)、广州市科技计划项目(NO.202002030075)的支持。
04
原文信息
Yuehua Wang, Zhenjie Wang, Fei Jia, Qing Xu, Zhilin Shu, Junlin Deng, Aimin Li *, Meng Yu*, Zhiqiang Yu*.
CXCR4-guided liposomes regulating hypoxic and immunosuppressive microenvironment for sorafenib-resistant tumor treatment.
Bioactive Materials, 17, (2022) 147–161.
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Bioactive Materials是一本高质量英文期刊，目前已经被SCIE、PubMed Central、Scopus、Embase收录。同时本刊还入选了2019年中国科技期刊卓越行动计划--“高起点新刊”项目。
2022年Bioactive Materials 获得影响因子16.874 ，在Materials Science，Biomaterials领域排名第一。
位于《2021年中国科学院文献情报中心期刊分区表》1区，TOP期刊。
CiteScore 2021: 14.3。