孙剑教授：点燃乙肝治愈新希望——对cccDNA再认识

2021年4月28日，“消除乙肝，从新开始”——新指标HBV RNA临床研究进展峰会于线上成功召开。会议上，南方医科大学南方医院的孙剑教授对“cccDNA再认识”进行了精彩分享。

乙肝治愈目标

孙剑教授首先分别讲述了乙肝的功能性治愈和完全治愈的区别。乙肝的功能性治愈是指，有限疗程停药后HBsAg消失,伴或不伴HBsAg血清学转换，血清中HBV DNA检测不到。乙肝的完全治愈是指，血清HBsAg持续检测不到，并且肝内cccDNA被清除。二者最为重要的区别是cccDNA是否被清除。
1、cccDNA的来源孙剑教授讲解到，cccDNA的来源主要是通过细胞内循环和细胞外循环两种循环途径进行补充。在细胞内循环中，胞内新合成的子代rcDNA直接进入细胞核内，形成cccDNA。在细胞外循环中，HBV DNA病毒颗粒进入肝细胞内，脱去外膜的rcDNA进入细胞核内，形成cccDNA。正是因为有内循环和外循环的补充，才使得肝细胞和cccDNA始终可以维持在一个恒定水平。
2、cccDNA的清除途径目前，我们对cccDNA的了解有限，认为cccDNA清除的四种可能途径如下：（1）免疫介导的溶细胞作用（如CD8+T细胞直接杀伤）；（2）免疫介导的非溶细胞作用（如直接降解cccDNA）；（3）肝细胞分裂；（4）细胞凋亡等。但具体哪条途径清除cccDNA的效果最好，我们暂时并不能确定。
3、cccDNA的沉默：转录活性的调控孙剑教授谈到，如今对cccDNA沉默的研究十分热门，其主要侧重点在于对宿主因素的研究，包括组蛋白乙酰化酶（p300/CBP家族等）、组蛋白去乙酰化酶（HDAC1、Sirt1、Sirt3等）、组蛋白甲基转移酶（PRMT1、PRMT5、SETDB1等）、组蛋白去甲基化酶（LSD1等），以及转录因子等。但是对直接靶向cccDNA的药物研发依旧困难重重，其主要原因有3个：（1）对cccDNA的合成机制认识不足，找不到直接抑制其合成的途径；（2）对cccDNA转录活性的调控更多的是对宿主的研究，但对宿主的调控伴随很多顾虑；（3）对cccDNA的清除认识还不够深刻。
4、清除cccDNA的现实途径孙剑教授谈到，既然不能直接清除cccDNA，那能不能通过耗竭的方式清除cccDNA呢？那么，我们就要首先回答耗竭原有的cccDNA究竟需要多久？孙剑教授分享了一项2004年发表在《Gastroenterology》杂志的小样本研究，该研究分析了22名阿德福韦酯（ADV）治疗的患者的cccDNA水平，研究发现ADV治疗48周后，患者的cccDNA水平下降0.8 log10cospies/cell（中位数）。同时基于数学模型推算的HBV cccDNA清除期约为14.5年。

但该研究并没有办法区分新生和原有cccDNA，其计算出的cccDNA清除期为14.5年具有一定的局限性。

cccDNA研究的新思路

对此，孙剑教授团队提出了区分原有和新生cccDNA的新研究思路，即通过HBV耐药位点（LAM^R）作为特征性标记区分新生和原有的cccDNA，以此来重新认识cccDNA的更新周期。开展研究前，首先要先找到一个cccDNA的替代指标，而血清HBV RNA是肝内cccDNA的直接下游产物，就是最佳的替代指标。

孙剑教授团队设计了两项队列研究，其中EFFORT队列研究的设计共纳入全国24家中心的599例乙肝患者。最终找到了5例符合单药治疗、发生病毒学突破、出现rtM204I/V LAM^R突变、最低病毒载量大于500 IU/ml，以及有匹配的肝活检样本的患者。

另一组ML18376队列研究设计纳入全国15家中心的255例拉米夫定耐药乙肝患者，所有患者被随机分为干扰素治疗组和阿德福韦酯治疗组。研究目的是对拉米夫定耐药患者转为干扰素治疗和阿德福韦酯治疗的效果进行对比。最终找出5例符合要求的患者，如下图所示。

1、血清HBV RNA与肝内cccDNA的相关性

孙剑教授讲述到，我们推测能通过监测血清HBV RNA突变型（LAM^R）比率的动态变化反映肝细胞内cccDNA的变化。研究发现，16~28周内患者血清HBV RNA LAM^R突变型从不可检测增加到40%~90%，推算出肝内cccDNA的拉米夫定耐药株的突变比例从0%增长为100%的周期为6.9~21.7周。

此外，拉米夫定耐药患者接受干扰素治疗后，100%LAM^R突变的血清HBV RNA在24~48周内恢复为野生型，因此推算出cccDNA更新的半衰期为5.6~11.1周。

2、cccDNA的更新周期

孙剑教授讲解到，肝内cccDNA从完全野生型变为100%的耐药突变型的变化过程，就代表了肝内cccDNA更新所需的周期。研究证实，cccDNA的更新周期为6个月而不是过去认为的14.5年。这提示我们，如果可以完全阻断cccDNA的补充，便可以实现在有限疗程内治愈慢乙肝。孙剑教授介绍到，该研究在2020年发表已在《Hepatology》杂志发表，宾夕法尼亚州立大学著名的微生物科学家Jianming Hu教授对此点评到，“cccDNA的半衰期一直尚未明确，但该研究采用一种新颖的方法解决了这一关键问题。通过监测血清HBV RNA遗传组成的动态变化，间接呈现了肝内cccDNA的更新动态”。
最后，孙剑教授总结到，我们要加快研发针对HBV复制的其他靶点用药，采取联合治疗手段阻断cccDNA补充，未来我们一定可以实现用有限疗程治愈乙肝患者。