耐药结核病的诊治进展
耐药结核病的诊治进展
Advances in the diagnosis and treatment of drug-resistant tuberculosis
来源：初乃惠,周文强. 耐药结核病的诊治进展[J]. 中华传染病杂志,2021,39(7):385-391.
DOI:10.3760/cma.j.cn311365-20210414-00133.
结核病作为全球疾病十大死因之一，是重大的公共卫生问题，其中耐药结核病(drug-resistant tuberculosis, DR-TB)是结核病控制面临的重大挑战。
WHO发布的《2020年全球结核病报告》显示，2019年全球估算新发结核病患者996万例，估算新发耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)/利福平耐药结核病(rifampicin resistant tuberculosis，RRTB)患者约46.5万例，登记报告MDR-TB/RRTB患者206 030例，占估算发病总数的44%。
在细菌学确诊的肺结核病例中仅61%开展了利福平耐药检测，MDR-TB/RRTB患者的治疗覆盖率为38%，其中中国仅为20.8%(13 525/65 000)，中国MDR-TB/RRTB患者的治疗成功率为57%，丢失率为29%。
由此可见，相当一部分结核病患者未被发现和诊断，特别是DR-TB患者，其耐药检测率较低，治疗覆盖率不足，治疗成功率低且丢失率高，这与WHO终止结核病的目标相去甚远。
因此，迫切需要加快DR-TB诊断的步伐，扩大治疗覆盖率，提高治疗成功率，减少丢失率。现围绕DR-TB诊断和治疗进展方面进行介绍。
一、DR-TB的分类
根据WHO的定义，DR-TB分为以下几类：
①单耐药结核病(mono-resistant tuberculosis，MR-TB)，对1种一线抗结核药物耐药；
②多耐药结核病(poly-resistant tuberculosis，PR-TB)，对1种以上的一线抗结核药物耐药，但不包括异烟肼和利福平同时耐药；
③ RRTB，对利福平耐药，不论对其他抗结核药物是否耐药；
④异烟肼耐药结核病(isoniazid-resistant tuberculosis，Hr-TB)，对异烟肼耐药但对利福平敏感；
⑤ MDR-TB，对包括异烟肼和利福平同时耐药在内的至少2种以上一线抗结核药物耐药；
⑥准广泛耐药结核病(pre-extensively drug-resistant tuberculosis，Pre-XDR-TB)，符合MDR-TB/RRTB定义，同时对任意一种氟喹诺酮类药物耐药；
⑦广泛耐药结核病(extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB)，符合MDR-TB/RRTB定义，同时对任意一种氟喹诺酮类药物和至少1种其他A组药物(贝达喹啉或利奈唑胺)耐药。
二、DR-TB的诊断
结核病的诊断以病原学诊断为金标准，DR-TB诊断的金标准是基于培养的表型药物敏感试验(以下简称药敏试验)，其对标本的结核分枝杆菌数量有较高要求且耗时长，不利于结核病的早期控制。
近年来随着全基因组测序技术的发展，结核分枝杆菌的耐药机制被不断解析，新的耐药诊断技术被开发和完善。
然而传统耐药诊断方法和新兴分子生物学方法各有优劣，相互补充，主要有以下几个方面。
(一)表型药敏试验
分枝杆菌培养是开展表型药敏试验的前提和基础，依据分枝杆菌培养基的不同，主要分为固体培养和液体培养。
表型药敏试验是在培养阳性的基础上进行的，由于涉及大量活菌操作，耗时较长，所以对技术人员操作熟练程度及实验室生物安全级别要求较高。
因此，以培养的方法来检测DR-TB受到了限制，特别是在经济欠发达地区。
(二)分子药敏试验及其进展
分子生物学技术通过对耐药相关的靶基因进行检测来诊断结核分枝杆菌的耐药性。
分子药敏试验建立在基因扩增的基础上，从结核分枝杆菌分离株或预处理的临床标本中检出耐药基因突变。
目前，主要的分子生物学检测技术有实时荧光定量PCR技术、线性探针技术、熔解曲线技术、基因测序技术等。
1．实时荧光定量PCR技术：
通过自动监测整个PCR过程中荧光信号的积累，检测PCR扩增产物并通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
其具有灵敏度高、特异性强、检测时间短、可重复性好等优点。
目前，用于结核分枝杆菌耐药检测的有Xpert MTB/RIF、Truenat MTB-Rif Dx和MAX-MDR-TB，其中前两者以结核分枝杆菌rpoB基因上利福平耐药决定区(rifampin resistance-determining region，RRDR)为靶标进行扩增，以实现对结核分枝杆菌和利福平耐药的检测。
Horne等纳入57项研究(共计8 287例结核病患者)进行分析，结果表明Xpert MTB/RIF检测利福平耐药的合并灵敏度和特异度分别为96%和98%。
2020年WHO快速通告指出Truenat MTB-Rif Dx的灵敏度达93%，特异度达95%；校正准确检出率为98.6%，对于RRTB突变位点的准确检出率，可涵盖超过全球90%已知的利福平耐药机制相关突变。
MAX-MDR-TB是检测临床标本中结核分枝杆菌复合群并同时检测异烟肼和利福平耐药性的新技术，与表型药敏试验相比，检测异烟肼和利福平耐药的灵敏度/特异度分别为58.3%/99.3%和100%/98.2%；与GenoType MTBDRplus相比，检测异烟肼和利福平耐药的灵敏度/特异度分别为100%/99.4%和100%/99.4%。
罗氏cobas MTB-RIF/INH是WHO 2020年新推荐用于DR-TB诊断的技术，通过核酸扩增来检测异烟肼和利福平耐药基因的突变，该方法检测利福平和异烟肼的灵敏度/特异度分别为88.4%/97.6%和76.6%/100%。
2．基于探针的药敏试验检测技术：
分子线性探针测定法即耐药结核分枝杆菌基因分型技术(GenoType MTBDR)，是基于DNA-DNA杂交技术的同时使用多个探针，针对常见耐药突变位点进行检测，检测周期为5～7 h。
目前，WHO推荐用于痰涂片阳性样本初步耐药筛查的线性探针包括GenoType MTBDRplus、Nipro NTM+MDR-TB和GenoType MTBDRsl，前两者通过检测rpoB、katG和inhA启动子区域的突变来探测异烟肼和利福平的耐药性。
GenoType MTBDRsl通过检测gyrA、rrs和embB基因突变来检测乙胺丁醇、喹诺酮类药物和二线注射剂的耐药性。
以表型药敏试验和靶标测序为参考，对379株菌和644份痰标本进行耐药性检测，结果表明GenoType MTBDRplus、Nipro NTM+MDR-TB对利福平耐药检测的灵敏度/特异度分别为90.3%～98.2%/97.8%～98.5%和92%～96.5%/97.5%～98.5%，对异烟肼耐药检测的灵敏度/特异度分别为89.1%～95.4%/98.8%～99.4%和89.6%～94.9%/97.6%～100%。
Gardee等的研究显示，与表型药敏试验相比，GenoType MTBDRsl version 2.0对氟喹诺酮类和二线注射剂耐药检测的灵敏度分别为100%和89.2%，特异度分别为98.9%和98.5%。
PZA-TB Ⅱ(PZA-LPA2)是日本Nipro公司推出的检测吡嗪酰胺耐药的分子探针，以表型药敏试验和基因测序为参考，在排除异质性耐药的情况下，PZA-LPA2检测吡嗪酰胺耐药性的一致率高达94.3%。
分子线性探针测定法可用于快速诊断XDR-TB和MDR-TB，然而由于抗结核药物的耐药分子机制尚未完全阐明，线性探针靶标仅限于常见的耐药突变位点，且这种新方法检测部分药物耐药性的灵敏度较差，加之设备昂贵，对实验室的条件要求较高，所以目前尚不能完全取代传统的培养和药敏试验。
3．探针熔解曲线技术：
探针熔解曲线技术是一种基于实时荧光定量PCR和熔解曲线分析相结合的新技术，通过分析特异性的探针与基因扩增产物的解链温度(Tm值)来判断待测基因是否发生突变，可以区分单个碱基的序列差异。
李春燕等以表型药敏试验为金标准，对200份痰涂片阳性患者的痰标本采用探针熔解曲线法检测耐药性，在初治患者中检测异烟肼、利福平耐药性的灵敏度和特异度分别为71.43%和96.77%、80%和97.92%；在复治患者中两药的灵敏度和特异度分别为35%和81.25%、82.35%和94.74%。
曹志华等以表型药敏试验为金标准，采用探针熔解曲线技术对153株临床分离株进行检测发现，对利福平和异烟肼耐药性检测的灵敏度分别达95.56%和90.57%。
Xpert MTB/RIF Ultra技术是Xpert MTB/RIF技术的改良版，以熔解曲线技术替代实时荧光定量PCR技术，Ultra较Xpert的检测极限更低[15.6集落形成单位(colony forming unit，CFU)/mL比112.6 CFU/mL]，检测的灵敏度显著提高，同时Ultra排除了rpoB基因Q513Q和F514F的沉默突变，克服了Xpert出现假阳性的部分限制。
Zifodya等纳入5项研究(共计930例结核病患者)，结果表明Ultra检测利福平耐药的总灵敏度和特异度分别为94.9%和99.1%，Xpert检测利福平耐药的灵敏度和特异度分别为95.3%和98.8%。
Xpert MTB/XDR技术是美国赛沛公司最新推出的GeneXpert 10色荧光技术，可同时扩增结核分枝杆菌的8个基因和启动子区，并使用松散分子信标(sloppy molecular beacon，SMB)探针分析解链温度(Tm值)以识别异烟肼、氟喹诺酮类、乙硫异烟胺和二线注射剂耐药相关的突变，90 min内获得结果。
Cao等的研究结果显示，在100份结核分枝杆菌阳性痰标本与214株临床分离株中，以表型药敏试验为参考标准，检测耐药性的灵敏度和特异度如下：异烟肼为98.3%和95%，氟喹诺酮类为91.4%和98.5%，二线注射剂为70%～98.1%和97%～99.7%，乙硫异烟胺为65.4%和97.3%。当以测序结果为参考标准时其灵敏度，异烟肼为99.7%，氟喹诺酮类为97.5%，二线注射剂为94.1%～100%，乙硫异烟胺为88.5%；除了乙硫异烟胺的特异度为97.3%外，其他药物的特异度均为100%。
该技术通过SMB探针识别突变特异的解链温度模式，可以区分异烟肼和氟喹诺酮类的低水平耐药和高水平耐药，以及二线注射剂的交叉耐药与单耐药。
该方法的检测极限与Xpert MTB/RIF相当。
与表型药敏试验相比，探针熔解曲线检测技术在结核分枝杆菌耐药性的快速检测方面有较高的阳性检测能力，同时更加简便、快捷。
但需要注意的是由于该方法检测的是碱基序列变化，所以对于一些碱基发生突变而氨基酸不变的无义突变则无法识别，会造成假阳性结果。
同时该方法仅覆盖一些常见的突变位点，因此对于复治结核病患者耐药诊断的灵敏度还有待提高。
4．其他新型耐药性检测技术：
①基因测序技术：
基因测序是一种新型基因检测技术，通过对病原体的基因序列进行测定分析，并与标准序列对比，以实现对结核分枝杆菌及其耐药性的精准检测。
有研究纳入7个国家共计7 094例结核病患者的临床分离株，以表型药敏试验作为参考，对一线和二线抗结核药物的耐药基因进行测序，结果表明对利福平、异烟肼、氟喹诺酮类、吡嗪酰胺、注射剂耐药性检测的灵敏度分别为91%、86%、85%～88%、54%、79%～90%，对MDR-TB和XDR-TB诊断的灵敏度分别为85%和74%。
Deeplex-MycTB(法国GenoScreen公司)是基于宏基因组学第二代测序技术研发的一项集菌种鉴定、基因型和耐药检测于一体的检测技术，通过检测一、二线抗结核药物相关的18个耐药基因来实现快速耐药检测，Deeplex-MycTB检测耐药性与表型药敏试验的一致性如下：异烟肼为94.9%，利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇均为97.4%，氟喹诺酮类为66.7%，丙硫异烟胺为75%，氨基糖苷类、利奈唑胺和贝达喹啉均为100%。
另一项研究采用全基因组测序的方法，纳入30多个国家6 465株结核分枝杆菌临床分离株，对抗结核药物耐药性检测的灵敏度和特异度如下：异烟肼分别为90%和97%，利福平分别为93%和98%，乙胺丁醇分别为90%和92%，乙硫异烟胺分别为88%和72%，吡嗪酰胺分别为65%和97%，链霉素分别为80%和91%，阿米卡星分别为85%和93%，卡那霉素分别为84%和98%，卷曲霉素分别为81%和95%，环丙沙星分别为89%和98%，莫西沙星分别为85%和90%，氧氟沙星分别为86%和96%，环丝氨酸分别为61%和90%，对氨基水杨酸分别为65%和94%；对MDR-TB、XDR-TB诊断的灵敏度和特异度分别为89%和100%、79%和98%。
目前所知的耐药突变位点无法解释所有的耐药表型，而全基因组测序技术可提供更为全面的耐药信息，但测序的大规模应用仍非常困难，原因如下：需要开发强大的软件和数据库工具提供支持；需要专门的人员和生物信息学设施进行数据采集和数据分析；宏基因组学第二代测序平台的高投入；需要确定新的突变是否会产生耐药性；需要大量高质量的DNA样品来完成测序，此外样本制备程序和DNA提取方法应标准化以保证一致性。
②基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(matrix-assisted-laser-desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)：
MALDI-TOF-MS是一种新型的软电离生物质谱，通过用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，使基质晶体电离进入飞行管，根据质荷比与飞行时间得出质谱峰图，之后对比参考图谱即可辨别样本分子。
Su等的研究结果表明，采用MALDI-TOF-MS技术和基因测序技术进行结核分枝杆菌耐药性双盲检测，两者检测结果的一致率达100%，与表型药敏试验符合率为90.6%，以表型药敏试验作为参考标准，其检测耐药性的灵敏度和特异度分别为83.8%和100%。
三、DR-TB的治疗
DR-TB有多种治疗方式，包括化学治疗(以下简称化疗)、外科治疗、营养支持治疗、宿主导向治疗、介入治疗、中医中药治疗等，其中化疗是最重要的治疗手段。
化疗分为长疗程治疗(18～20个月)和短疗程治疗(9～12个月)两种模式，两者在设计原则、药物组成、适应证和患者负担等方面均有所不同，因此选择合理的化疗方案对提高DR-TB患者的治疗成功率尤为重要。
(一)化疗方案的制订
1．利福平敏感结核病：
对于利福平敏感的MR-TB和PR-TB患者，参考药物的5组分类，根据药敏试验结果，由第1组顺序向下选择合适的抗结核药物，强化期至少选择4种、巩固期至少选择3种有效的一线药物，只有在一线药物不能组成有效方案时，才考虑选择二线药物，总疗程一般为9～12个月。
对于Hr-TB患者，WHO指南推荐治疗方案为6(H)-R-Z-E-Lfx[6为6个月，(H)为加或不加异烟肼，R为利福平，Z为吡嗪酰胺，E为乙胺丁醇，Lfx为左氧氟沙星]；《耐药结核病化学治疗指南(2019年)》建议治疗强化期至少选择4种、巩固期至少选择3种有效的一线抗结核药物，推荐治疗方案为6-9R-Z-E-Lfx(6-9为6～9个月，R为利福平，Z为吡嗪酰胺，E为乙胺丁醇，Lfx为左氧氟沙星)。
2．RRTB：
对于MDR-TB/RRTB患者，根据其药敏试验结果、治疗史、合并症等情况综合分析选择长疗程方案或短疗程方案。
2018年，WHO根据有效性和安全性的最新证据，将长疗程方案中使用的药物按先后顺序重新划分为A、B、C三组。
①长疗程治疗方案：
MDR-TB/RRTB长疗程治疗方案是指至少由4种有效抗结核药物组成的18～20个月的治疗方案，可分为标准化或个体化方案。
强化期为6～8个月，巩固期为12个月，方案中应包括2～3种A组药物和1～2种B组药物，如果不能单纯由A组和B组药物组成，则添加C组药物组成方案，口服药物优先于注射剂。
长疗程方案的优势在于增加DR-TB患者特别是复治患者治疗成功的可能性，降低其死亡风险；保证肺部病变在足够长的时间内获得较为完善的修复；尽可能杀灭持留菌，有效阻止内源性复发。
但长期联用多种抗结核药物也会导致不良反应发生率的增高、经济负担的加重、全程治疗依从性的变差。
②短疗程治疗方案：
由于长疗程治疗方案的弊端和抗结核新药的研发进展，安全、有效的短疗程治疗方案已成为目前研究的趋势。2010年，Van Deun等报道了在孟加拉国采用9个月短疗程化疗方案治疗MDR-TB的疗效，获得了87.8%的无复发治愈率。
至此拉开了短疗程化疗方案研究的序幕，喀麦隆、尼日尔等国家的研究者相继使用短疗程化疗方案取得了更好的疗效，治疗成功率超过90%。
基于这些研究结果，WHO在2016年更新版指南中推荐，对于接受二线抗结核药物治疗<1个月、对氟喹诺酮类药物和注射类药物敏感的MDR-TB/RRTB患者，采用短疗程方案，由高剂量莫西沙星、氯法齐明、吡嗪酰胺和乙胺丁醇组成，在强化期采用卡那霉素、丙硫异烟胺和高剂量异烟肼，强化期为4～6个月，巩固期为5个月。
2019年WHO推出的整合版指南不再推荐使用卡那霉素和卷曲霉素；随后研究结果证实，该短疗程方案在主要结局指标方面不劣于长疗程方案(良好治疗结局为78.8%比79.8%)，治疗结束后24个月的无复发治疗成功率达79.3%。
鉴于注射类药物不良反应的发生率高、耐受性差的问题和抗结核新药研究的最新进展，采用全口服化疗方案已成为研究热点。
对南非耐药结核电子登记网络(EDRweb)10 152例MDR-TB患者的个体医疗记录分析，包括了891例使用含贝达喹啉的全口服短疗程方案患者、987例使用含注射剂标准治疗方案患者，结果显示全口服短疗程方案的治疗成功率显著高于含注射剂的标准短疗程方案(73%比60%)。
研究表明，基于治疗成功的含贝达喹啉方案比含注射剂方案更具成本效益，短疗程方案成本减少18%～20%，长疗程方案减少49%～54%。
基于上述研究结果，2019年12月WHO关于DR-TB治疗重大变化的快速通告推荐，既往未接受过二线药物(包括贝达喹啉)且无氟喹诺酮类药物耐药、非多发结核病变或重度肺外结核的MDR-TB/RRTB患者，首选含贝达喹啉的全口服短疗程化疗方案，并建议在国家结核病防治规划中对这部分患者逐步停用含注射剂的短疗程化疗方案。
同年，南非卫生部颁布的RRTB管理临床参考指南推荐RRTB患者采用9～11个月的全口服短疗程方案[4-6Bdq(6m)-Lzd(2m)-Cfz-Lfx-Hh-Z-E/5Lfx-Cfz-Z-E；4-6为4～6个月的强化期，Bdq(6m)为6个月的贝达喹啉，Lzd(2m)为2个月的利奈唑胺，Cfz为氯法齐明，Lfx为左氧氟沙星，Hh为高剂量异烟肼，Z为吡嗪酰胺，E为乙胺丁醇，5为5个月的巩固期]，或18～20个月的长疗程全口服方案。
2020年WHO结核病实用指南模块4中指出，对于确诊的符合条件的MDR-TB/RRTB患者(即此前接受本方案中所含二线抗结核药物治疗不超过1个月，可以排除对氟喹诺酮耐药的患者)，建议使用9～12个月含贝达喹啉的全口服方案[4-6Bdq(6m)-Lfx(Mfx)-Cfz-Z-E-Hh-Eto/5Lfx(Mfx)-Cfz-Z-E；4-6为4～6个月的强化期，Bdq(6m)为6个月的贝达喹啉，Lfx为左氧氟沙星，Mfx为莫西沙星，Cfz为氯法齐明，Z为吡嗪酰胺，E为乙胺丁醇，Hh为高剂量异烟肼，Eto为乙硫异烟胺，5为5个月的巩固期]。
短疗程方案的优势在于疗程短，治疗费用较低，患者依从性好，治愈率较高，但其适用条件较为严苛，符合条件的患者较少。
尽管WHO最新指南推荐在短疗程方案中以贝达喹啉替代注射类药物，但是研究表明约5%的患者可能对贝达喹啉初始耐药，另有5%的患者在治疗中可能产生耐药。
因此，如果以利奈唑胺替代注射剂的短疗程方案安全、有效，则贝达喹啉可作为二线注射类药物和对利奈唑胺有禁忌或治疗失败的RRTB患者的选择。
关于利奈唑胺替代注射剂的研究较少，需要更大规模的队列研究证明利奈唑胺是否可安全地取代短疗程方案中的二线注射类药物，并保护氟喹诺酮免受获得性耐药的影响。
目前，笔者所在研究团队正在开展利奈唑胺替代注射剂的全口服短疗程治疗方案研究。
(二)DR-TB治疗新方案的临床研究
NC-005研究纳入60例RRTB患者，分为吡嗪酰胺敏感组和耐药组，给予BPaMZ方案(B为贝达喹啉，Pa为普托马尼，M为莫西沙星，Z为吡嗪酰胺)，结果表明两组液体培养中位阴转时间分别为41 d和49 d，液体培养阴转率分别为96%和79.8%，固体培养阴转率分别为100%和95%，无患者Q-Tc间期超过500 ms，也未发生与治疗相关的死亡；BPaMZ方案治疗RRTB患者的痰菌阴转时间显著短于HRZE(H为异烟肼，R为利福平，Z为吡嗪酰胺，E为乙胺丁醇)一线方案治疗敏感的结核病患者，前者杀菌活性优于后者，且两者安全性相当。
Nix-TB研究纳入了109例XDR-TB和难治性MDR-TB患者，给予BPaL方案(B为贝达喹啉，Pa为普托马尼，L为利奈唑胺)，分别有89%和92%的患者获得了支持性结果，结束后随访6个月有90%的患者达到良好的治疗结局。
基于Nix-TB的良好治疗结果，2020年WHO结核病实用指南模块4中推荐，在实施性条件下，6～9个月的BPaL方案可用于治疗对氟喹诺酮类药物耐药、既往未暴露于贝达喹啉和利奈唑胺或暴露时间短于2周的MDR-TB患者。
endTB研究是一项Ⅲ期非劣效随机对照观察性研究，对含有贝达喹啉或德拉马尼的治疗方案进行安全性和有效性分析，结果表明含德拉马尼的方案组中有80%的患者6个月内痰菌阴转。
目前，国际和国内正在进行多项以贝达喹啉、德拉马尼等新药为核心的临床研究，如STREAM-Ⅱ、ZeNix、TB PRACTECAL、endTB-Q、SimpliciTB、MDR-END、TB-TRUST等，基于这些正在进行的临床研究，未来几年有望看到DR-TB临床治疗方案的重要变化。
四、结语
我国现阶段仍是结核病高负担国家，DR-TB的传播加剧了结核病防控的难度，实现DR-TB的早诊、早治仍是当前及未来一段时间努力的方向。
分子生物学诊断技术的更新发展弥补了传统技术的不足，但由于抗结核药物耐药相关机制尚未完全阐明，其在假阳性(突变而表型敏感)和假阴性(无突变但表型耐药)方面仍有待进一步探索，同时分子检测的发展必须要有高精度的表型药敏试验作为参考，因此两者相结合才能在DR-TB的诊断方面提供更高的精确度。
正确的诊断是首要环节，合理、有效的治疗是终止结核病传播的另一个重要环节，并且耐药性检测在治疗过程中也是必不可少的。
随着抗结核新药的不断研发上市，全球对DR-TB新方案的临床试验成果的陆续更新，治疗方案正向短程化、全口服、安全有效的趋势发展，这对改善DR-TB的治疗及预后，乃至终止结核病都是一个很好的态势。
但结核分枝杆菌获得性耐药能力较强，新药引入后耐药性迅速出现，因此临床试验中新药的评价应与标准化药敏试验的开发同步进行，当将新药引入治疗方案后，相应的药敏试验应能进行检测，这对终止DR-TB的流行至关重要。