低分子量肝素对新冠肺炎急性呼吸窘迫综合征的治疗作用
新型冠状病毒肺炎（COVID-19）是以发热、干咳、咽痛、乏力等急性呼吸道感染症状为主要临床表现的传染性疾病，严重者可出现急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、多器官功能衰竭甚至死亡。截至2021年4月19日，全球确诊病例超过1.4亿例，死亡病例超过304万例。由于尚缺乏治疗COVID-19的特效药物，如何有效治疗重症及危重症患者，改善患者预后，降低死亡率，是当前全世界面临的一个巨大挑战。
肺为COVID-19的主要靶器官，其病理表现主要有弥漫性肺泡损害伴浆液、纤维蛋白性渗出，细胞脱屑和透明膜形成。死亡患者肺内有大量CD4+和CD8+淋巴细胞浸润，而外周血T细胞数量明显减少，且均处于过度激活状态，白细胞介素（IL）-6等促炎因子水平明显升高。可见，免疫过激和炎症风暴是导致COVID-19患者严重肺损伤甚至发展为ARDS的重要原因。肺小血管和肺泡毛细血管充血、水肿，可见单核细胞和淋巴细胞浸润及血管内透明血栓形成，大量CD61+巨核细胞存在于肺小血管和肺泡毛细血管内并活跃地产生血小板。小血管内的纤维蛋白和血小板周围有大量中性粒细胞聚集，提示炎症和凝血系统之间的相互作用。
临床研究发现COVID-19重症及危重症患者存在明显的凝血功能异常。D-二聚体显著升高在住院患者中常见，且与预后不良有关。Zhou等进行的一项回顾性队列研究报道，入院时D-二聚体水平>1 μg/ml者的死亡风险是≤1 μg/ml患者的18.42倍（95%CI：2.64~128.55）。Zhang等的研究分析则表明，入院时D-二聚体水平高于2 μg/ml者死亡风险显著增加（HR=51.5，95%CI：12.9~206.7）。其他凝血相关实验室异常还包括纤维蛋白原水平明显升高（尤其是死亡患者），抗凝血酶含量低，血小板减少等。近3/4的COVID-19死亡患者存在弥散性血管内凝血（DIC），且以血栓为主要表型。凝血功能异常导致的肺泡内纤维蛋白沉积及微血管血栓形成是患者进行性呼吸功能障碍的重要原因，微血管血栓也解释了为什么危重症患者床边超声常见右心应变的证据。另外，COVID-19患者静脉血栓栓塞症（VTE）的报道十分常见，尤其是合并肺栓塞，是造成患者病情加重甚至死亡的重要原因之一。
各种致病因素的刺激激活肺内免疫细胞，后者释放大量促炎因子和趋化因子，募集并激活免疫细胞，引起级联放大的炎症反应。大量细胞因子、颗粒酶、氧自由基等损伤肺泡上皮细胞和微血管内皮细胞，血管通透性增高，大量富含蛋白质的水肿液积聚，肺泡内及血管外纤维蛋白沉积，血管内血栓形成，导致气体交换障碍，出现进行性和难治性低氧血症，最终导致患者呼吸衰竭甚至死亡。
凝血系统活化和炎症反应组成的正反馈网络在肺损伤中起着重要作用。肺泡内凝血活性增加而纤溶活性下降是ARDS的重要特征。组织因子（TF）是外源性凝血途径的始动因素，通过活化因子Ⅶ激活下游凝血瀑布。正常情况下，TF主要由血管壁外膜细胞表达；病理条件下，单核细胞、中性粒细胞和内皮细胞可表达大量TF并释放TF阳性的细胞微粒进入血液循环，在凝血瀑布中起到级联放大的作用。多种炎性细胞因子如肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-1、IL-6等可刺激TF的表达增强凝血反应，并刺激纤溶酶原激活物抑制剂（PAI）的产生而降低纤溶活性。炎症反应还可影响机体对凝血过程的正常调节。正常生理状态下，凝血途径受到天然凝血抑制物包括活化蛋白C（APC）、抗凝血酶（AT）和组织因子途径抑制物（TFPI）的调节。病理状态下，这些凝血抑制物消耗增加，合成受损，导致其水平下降，凝血和抗凝平衡失调。此外，分布在血管内皮表面的血栓调节蛋白（TM）与凝血酶结合后可促进其活化蛋白C，后者可选择性灭活Ⅴa和Ⅷa，从而调节凝血过程。TNF、IL-1等炎症细胞因子可介导内皮表面的TM下调，抑制APC途径。血管内皮损伤也使其抗血栓的保护功能减弱。以上因素共同作用使患者处于高凝状态。大量凝血酶及其他凝血蛋白酶又可激活单核细胞、内皮细胞和白细胞表面的蛋白酶激活受体，促进促炎细胞因子的释放并增加与白细胞渗出和结合相关的表面蛋白的表达，产生强大的促炎效果。凝血系统活化和炎症反应相互放大，导致肺组织进一步损伤。
（一）抗凝作用
肺泡内凝血和纤溶系统紊乱，纤维蛋白沉积和微血栓形成是ARDS的重要特征之一，纠正凝血功能紊乱可改善和减轻肺损伤。LMWH通过与抗凝血酶Ⅲ结合，主要抑制凝血因子Ⅹa发挥抗凝作用，对凝血酶（Ⅱa）的影响相对较小。肝素与LMWH还可诱导血管内皮细胞释放TFPI，抑制FⅦa/TF复合物。此外，研究表明肝素还可从转录水平抑制活化的单核细胞合成TF和PAI，达到抗凝和促纤溶效果。国内一项临床随机对照试验的荟萃分析表明LMWH可改善患者的氧合指数，说明LMWH在改善微循环障碍方面有重要作用。这可能与LMWH抑制微血管内血栓形成，并促进已形成的微血栓溶解有关。
（二）抗炎作用
除了经典的抗凝抗栓作用外，大量研究表明LMWH还具有一定的抗炎作用。炎症反应是ARDS的重要病理生理机制之一，免疫过度激活所致的炎症因子风暴是引起和加重肺损伤的关键环节。LMWH可显著减少炎症因子的释放；抑制炎症细胞的滚动、黏附和渗出，减少肺内中性粒细胞聚集，减轻炎症反应。
体外实验表明，药理剂量的LMWH和普通肝素能显著减少脂多糖（LPS）诱导后的单核细胞释放TNF-α、IL-8、IL6和IL-1β等炎症因子。在LPS诱导的肺损伤大鼠模型中，LMWH治疗可显著降低TNF-α、IL-1β和高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的水平。HMGB1是败血症过程中的晚期炎症介质。可刺激单核细胞进一步释放大量炎症因子，诱导肺损伤和致命性的炎症反应。LMWH对炎症介质的调节作用可能是通过抑制NF-κB活化和核转位实现的。活化的NF-κB可协调诱导多个编码促炎细胞因子合成和释放的基因表达，是炎症反应中的重要环节，LMWH治疗可使NF-κB的活化水平明显降低。Riewald等［23］发现凝血因子Ⅹa可以显著活化NF-κB，而LMWH可通过凝血酶Ⅲ有效抑制凝血因子Ⅹa，这可能是LMWH抑制NF-κB的机制之一。
此外，研究发现LMWH可影响白细胞的滚动、黏附和渗出过程，减少肺内炎症细胞聚集。细胞间黏附分子-1（ICAM-1）是中性粒细胞渗出迁移的重要分子。在LPS诱导的大鼠模型中，免疫组化分析提示LMWH治疗组大鼠肺组织中ICAM-1的水平显著低于未治疗组。LMWH或可通过抑制ICAM-1的表达减轻肺内中性粒细胞俘获，但该研究未进行蛋白表达层面的验证。正常生理状态下，内皮细胞表面的多种受体被由多糖和吸附蛋白组成的内皮表层（ESL）所覆盖，抑制固有免疫激活、细胞渗出和血栓形成。炎症过程中，ESL被酶解脱落可使白细胞黏附受体暴露，血管通透性增加。Lipowsky和Lescanic通过活体荧光显微镜检技术发现LMWH可剂量依赖性地减轻炎症所致的ESL脱落并减少白细胞黏附，且ESL越紧密，白细胞黏附越少。这可能与LMWH和内皮细胞表面糖被的多种成分结合增加了ESL的稳定性从而抑制了白细胞与内皮细胞间的相互作用有关。另一方面，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖是ESL的重要成分，LMWH通过抑制肝素酶减少硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的降解也可能是其减少ESL的脱落的机制之一。
（三）抗氧化作用
炎症反应过程中氧化应激增强是组织损伤的重要机制之一。肝素和LMWH具有抗氧化作用，可减轻多种原因所致的氧化应激。研究表明，ARDS动物肺内超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶活性下降，丙二醛（MDA）含量升高；LMWH可提高SOD、GSH-Px等抗氧化酶的活性，降低MDA含量，减轻ARDS的氧化应激反应，减少组织损伤。LMWH是一类结构复杂的糖胺聚糖，其结构上的还原性羟基可捕捉过氧化反应中产生的活性氧，也可与金属离子如Fe2+、Cu2+络合，抑制脂质过氧化的启动，发挥抗氧化作用。
目前，肝素、LMWH在大量临床前研究中表现出了对ARDS的保护和治疗作用，但高质量临床研究仍较少。Hofstra等的一项回顾性研究纳入了ICU中164例接受静脉注射肝素治疗的ARDS患者，表明早期应用肝素对ARDS患者28 d死亡率及ICU住院时间影响无统计学意义。国内一项荟萃分析显示，肝素、LMWH治疗可降低ARDS患者的7 d病死率和急性生理学与慢性健康状况Ⅱ（APACH Ⅱ）评分。遗憾的是，该分析仅纳入了6项随机对照研究，且文献质量不高，异质性较强。
ARDS是COVID-19患者重要的病理生理过程，炎症反应和凝血系统活化之间的相互作用是ARDS进展的关键环节。LMWH一方面可抑制血栓形成，促进纤维蛋白溶解，改善氧合；另一方面又可抑制炎症反应，减少促炎因子的释放和免疫细胞的渗出和迁移，减轻免疫过度激活所致的肺损伤，从而发挥一定的保护和治疗作用。Shi等的一项队列研究比较了LMWH治疗患者与未使用LMWH者（对照组）治疗前后凝血指标、炎症因子等实验室指标的改变，发现LMWH治疗后患者D-二聚体水平及纤维蛋白（原）降解产物（FDP）水平显著降低，且IL-6水平下降、淋巴细胞比例升高，该变化与对照组差异有统计学意义，表明LMWH可改善COVID-19患者的凝血功能紊乱，同时其抗炎作用可减轻炎症反应，抑制炎症与凝血之间的相互作用，减少组织损伤。Tang等发表的一项回顾性研究表明，肝素治疗（以LMWH为主，治疗7 d及以上）对总体重症COVID-19患者28 d死亡率影响无统计学意义，但可使SIC评分≥4或D-二聚体>正常上限6倍的患者的28 d死亡率降低，表明LMWH肝素治疗可使伴有严重凝血障碍的COVID-19患者获益。
然而，关于COVID-19患者中LMWH的应用仍存在争议。荷兰的一项研究表明即使在标准剂量预防性抗栓治疗的基础上，COVID-19患者VTE的发生率仍可达27%，提示COVID-19患者的凝血病存在一定的特殊性。不少患者纤维蛋白原水可高达700 mg/dl以上，同时伴有抗凝血酶水平降低，这可能使COVID-19患者对肝素类药物的抵抗性增加，标准预防性剂量的LMWH或许不足以发挥作用。Ranucci等研究发现增加预防性LMWH剂量后，COVID-19患者纤维蛋白原、D-二聚体、IL-6水平明显降低，且无主要血栓栓塞事件发生，表明增加LMWH的剂量或可更好地预防血栓形成，并抑制炎症反应。由于该研究样本量小、非随机对照，增加预防性LMWH剂量能否改善患者预后仍不明确。Mattioli等的一项回顾性研究提示中等剂量的LWMH在老年COVID-19患者中可能有较好的安全性，主要出血事件发生率为1.9%，未出现致命性出血；85岁以上患者死亡率高于相对年轻的患者，但出血风险未增加。目前有一项评估高预防剂量LWMH在重症COVID-19中的疗效和安全性的随机对照研究正在进行中（EudraCT 2020-001972-13）。
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