碳青霉烯类耐药革兰阴性菌联合药敏试验及报告专家共识
碳青霉烯类抗菌药物包括亚胺培南、美罗培南和厄他培南等，是治疗多重耐药革兰阴性菌所致感染最有效的抗菌药物之一。随着该类药物在临床的广泛使用，碳青霉烯类耐药细菌(carbapenem-resistant organisms，CRO)的检出率呈逐年上升趋势，其中以肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌为代表。CHINET中国细菌耐药监测网2021年监测结果显示，我国临床分离肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌对亚胺培南的耐药率分别为23.1%、23%和71.5%。由于CRO通常还携带对其他抗菌药物耐药的基因，呈广泛耐药甚至全耐药的特征，使临床的抗感染治疗面临无药可用的困境，导致感染患者的高病死率。CRO感染治疗面临的困境急需实验室开展联合药敏试验，多药联合治疗可延长抗菌药物的使用寿命，体外联合药敏试验证实两药呈协同或相加作用的联合，能有效改善CRO感染患者的病死率。联合药敏试验可通过两药/多药组合分析不同药物之间的协同抗菌活性，在筛选针对CRO菌株所致感染的精准抗感染治疗方案中发挥重要作用。
为规范碳青霉烯类耐药革兰阴性菌联合药敏试验及报告，上海市微生物学会微生物耐药防控专委会、CHINET中国细菌耐药监测网和上海市细菌真菌耐药监测网组织专家对上述问题进行了讨论，撰写了专家共识并对联合药敏试验方法和结果报告进行了推荐，以期对各医疗机构开展针对CRO菌株的联合药敏试验及报告提供帮助。碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌(carbapenem-resistant, Enterobacterales)定义为满足以下任意一个条件：①对亚胺培南、美罗培南、厄他培南或多利培南任何一种碳青霉烯类抗菌药物耐药者。对于天然对亚胺培南敏感性降低的细菌（如摩根菌属、变形杆菌属和普罗威登菌属等），需参考除亚胺培南外的其他碳青霉烯类抗菌药物的药敏结果；②产生碳青霉烯酶。
碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌(carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa, CRPA)和碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌(carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii, CRAB)定义为对亚胺培南、美罗培南或多利培南任何一种碳青霉烯类抗菌药物耐药者。产生碳青霉烯酶是肠杆菌目细菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药最主要的机制，包括A类丝氨酸碳青霉烯酶（以KPC酶为主）、B类金属β内酰胺酶（以NDM型金属酶为主）和D类丝氨酸碳青霉烯酶（以OXA-48 型酶为主）。
铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药的主要机制包括AmpC酶高表达合并外膜渗透屏障、外排泵高表达以及产生碳青霉烯酶（包括KPC型碳青霉烯酶和金属β内酰胺酶）等。鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药的主要机制是天然产生OXA-23、OXA-24或OXA-51型酶。3. 开展联合药敏试验的时机
仅当药敏试验结果显示细菌对常规所有测试的抗菌药物均耐药，或临床医师有特殊治疗需求时，开展联合药敏试验筛选可能的多药联合治疗方案。开展联合药敏试验的时机参考图1。
当前临床微生物实验室常规采用的药敏试验方法包括肉汤微量稀释法、肉汤宏量稀释法、琼脂稀释法、E试验法、自动化药敏仪器和纸片扩散法。除纸片扩散法为定性检测方法外，其余均为定量检测方法。联合药敏试验方法包括肉汤微量稀释棋盘法、琼脂稀释棋盘法、纸条法（包括E试验条和MTS条）、纸片扩散法和联合杀菌曲线等。肉汤微量稀释棋盘法和琼脂稀释棋盘法是联合药敏试验的标准参考方法，但该方法操作繁琐且基本为手工操作，导致常规实验室开展的可操作性差。因此，操作简单灵活的纸条法和纸片法不失为常规实验室联合药敏可选择的方法。
专家共识一：联合药敏试验是临床微生物室常规药敏试验的补充，仅对多重耐药菌如碳青霉烯类耐药革兰阴性菌或临床医师有特殊治疗需求的耐药菌株进行联合药敏试验，其他菌株不建议常规开展联合药敏试验。
专家共识二：联合药敏试验方法首选肉汤微量稀释棋盘法，若实验室无法开展肉汤微量稀释棋盘法，可以纸条法或纸片扩散法替代。但需注意的是，纸条法或纸片扩散法结果仅供参考，如需确认应采用肉汤微量稀释棋盘法。常用部分抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentration index，FIC）为判断依据，即① FIC≤0.5：协同作用，提示两种药物联合后的抗菌活性显著大于各单药；② FIC＞0.5～1：相加作用，提示两种药物联合后的抗菌活性较各单药稍有增加；③ FIC＞1～2：无关作用，提示两种抗菌药物的活性均不受另一种药物的影响；④ FIC＞2：拮抗作用，提示一种抗菌药物的活性被另一种抗菌药物削弱。
专家共识三：在进行联合药敏试验前，应先进行单药的药敏试验，优先选择敏感的抗菌药物进行联合，或以两药MIC值为中心，上下3～4个浓度进行交叉联合，开展联合药敏试验。
由于不同种类的抗菌药物对产生不同碳青霉烯酶菌株的体外抗菌活性不同，不同耐药菌由于耐药机制的差异导致其对抗菌药物的敏感性不同。因此，应根据不同的CRO菌株制定不同的抗感染治疗方案。如头孢他啶-阿维巴坦对于产KPC酶或OXA-48型酶肠杆菌目细菌具有高度抗菌活性，但对于产金属酶菌株需联合氨曲南；替加环素对碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌和鲍曼不动杆菌具有高度抗菌活性，但对铜绿假单胞菌无抗菌活性；而多黏菌素（包括多黏菌素B和黏菌素）对上述三种耐药菌均具有高度抗菌活性（天然耐药菌株除外）。
除此之外，磷霉素对肠杆菌目细菌具有较强抗菌活性，但对铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌基本无抗菌活性；阿米卡星对CRO菌株具有一定抗菌活性，需根据药敏试验情况而定；而头孢哌酮-舒巴坦（尤其是舒巴坦加大剂量）对于CRAB仍具有一定抗菌活性。基于此，实验室在开展针对CRO菌株的联合药敏试验时，需根据不同耐药菌的特征而设计针对性的多药联合药敏试验方案。 专家共识四：各实验室应根据本院CRO菌株耐药机制，制定不同联合药敏试验的抗菌药物组合。 专家共识五：对于新β内酰胺类抗生素-β内酰胺酶抑制剂复方制剂，如头孢他啶-阿维巴坦、美罗培南-韦博巴坦和亚胺培南-瑞来巴坦等，若药敏试验结果显示对该类复方制剂敏感，可直接用于敏感菌所致感染的治疗，无需开展联合药敏试验。 专家共识六：对于不同CRO菌株联合药敏试验抗菌药物的选择，应参考临床抗感染治疗指南或专家共识确定，具体参考表1。
7. 联合药敏试验方法学简介、优缺点和结果判读（表2）
肉汤微量稀释棋盘法用于测定抗菌药物抑制或杀灭微生物的最低浓度，通常以mg/L为单位。抗菌药物A和抗菌药物B经倍比系列稀释后，以不同浓度组合进行混合，经过孵育后阅读单药及两药联合后的MIC。肉汤微量稀释法使用的96孔微量板在最终接种完成后通常每孔中液体终体积为0.1 mL，细菌终浓度为5×105 CFU/mL。作为参考方法，肉汤微量稀释棋盘法可精确测定细菌对抗菌药物的敏感性，明确两药之间是否存在协同、相加、无关和拮抗作用（图2和图3）。但该方法比较耗时，工作量大且对方法学技术要求高，因此一般仅用于科学研究，常规实验室通常较少开展。
琼脂稀释棋盘法是将两种抗菌药物分别配制成单独的不同浓度的溶液，之后以不同的两药药物浓度组合加入到每一块琼脂平板中，配置成含抗菌药物浓度成倍比系列稀释的药物平板。使用多点接种器将制备好的细菌菌悬液点种到琼脂表面，经35℃ 16～20 h培养后，肉眼观察细菌生长，以未见细菌生长平板的最低药物浓度为MIC（图4）。其优点是每个平板可同时测定多株细菌，可直接观察受试菌生长是否良好或污染等。但该方法与肉汤微量稀释棋盘法一样比较耗时，工作量大且对方法学技术要求高，因此一般仅用于科学研究，常规实验室通常较少开展。纸条法亦称梯度扩散法，所用材料名称为E试验条（Epsilometer，E-test）和MIC测试条（MIC test strip，MTS），是一种商品化的定量测定细菌对抗菌药物敏感性的方法。它结合了稀释法和扩散法的原理和特点，操作同纸片扩散法一样简便易行，结果又如同稀释法一样，可获得定量的MIC值，结果准确，重复性好。纸条法包括两种：①纸条优加法，操作时在一块已涂布菌液的MHA平板上贴上含抗菌药物A和抗菌药物B的纸条；在另一块已涂布菌液的MHA平板上先贴上含抗菌药物A的纸条，30 min后，待抗菌药物A完全渗透入琼脂中后移去纸条，再在相同的位置覆盖贴上抗菌药物B。过夜孵育后阅读抗菌药物A单药、抗菌药物B单药以及抗菌药物A和抗菌药物B堆叠后的MIC（图5）。②纸条交叉法：抗菌药物A和抗菌药物B纸条垂直交叉放置（单药MIC处交叉，因此需提前测定单药MIC），孵育后阅读联合后抗菌药物A和抗菌药物B的MIC，计算FIC指数，判断两药是否存在协同、相加、无关和拮抗作用（图6）。纸条法具有操作简单的特点，且结果容易阅读。专家共识七：两药协同定义为该菌对抗菌药物A和抗菌药物B单药均为耐药，但抗菌药物B在抗菌药物A存在时表现为敏感或中介。
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物吸收琼脂中的水分后向纸片周围扩散，随着扩散距离的增加抗菌药物的浓度呈对数减少，在纸片的周围形成递减浓度梯度。在纸片周围抑菌浓度范围内的测试菌不能生长，而抑菌浓度范围外的菌株则继续生长，从而在纸片的周围形成抑菌圈。操作时将两张不同抗菌药物的药敏纸片以一定的距离放置，参考距离为一张纸片的边缘距离另外一张纸片的抑菌圈边缘3～4 mm。经过孵育后根据两药间的抑菌圈扩大或缩小等现象，判断两药是否存在协同、相加、无关或拮抗现象（图7和图8）。纸片扩散法具有操作简单且价格低廉的特点，但缺点是结果不易阅读。纸片扩散法联合药敏试验两药敏纸片的距离可参考图8。若常规纸片扩散法联合药敏试验结果模糊，难以判断，建议使用其他方法（如肉汤微量稀释棋盘法、纸条法）进行确认。优先选择敏感的抗菌药物A作为关键药物与其他抗菌药物进行联合，如头孢他啶-阿维巴坦、替加环素或多黏菌素。纸片优加法常规纸片扩散法的改良方法。实验时按图示先将2张含抗菌药物A单药和1张含抗菌药物B单药纸片贴在已接种菌液的MH琼脂表面，3张纸片间的中心距离为25 mm。放置30 min后，待纸片中的抗菌药物完全渗透入琼脂中后，按图示移去一张A纸片，再在相同的位置上覆盖贴上抗菌药物B单药纸片。经孵育后阅读抑菌圈直径，见图9。专家共识八：两药协同定义为抗菌药物A和抗菌药物B单药均为耐药，但抗菌药物B在抗菌药物A存在时表现为敏感或中介（即两药联合的抑菌圈直径明显大于任何单药抑菌圈直径）。
本方法与纸片优加法原理相似，目的为增加有效抗菌药物的含量，达到加大剂量实现抑菌或杀菌的目的，如常可用此法增加头孢哌酮-舒巴坦对CRAB的抗菌活性。操作方法同常规纸片扩散法，唯一的不同之处为多张同一抗菌药物纸片紧邻贴在一起，以实现该区域该抗菌药物浓度加量的目的。由于舒巴坦对鲍曼不动杆菌存在杀菌活性，增加舒巴坦剂量可明显提高鲍曼不动杆菌对头孢哌酮-舒巴坦的敏感率，可尝试以头孢哌酮-舒巴坦为基础联合舒巴坦的联合药敏试验方案。见图10。（1）常规肉汤纸片洗脱法：此方法为两种不同抗菌药物的联合。实验时在4根无菌试管中分别加入2 mL的CAMHB肉汤，分别标记为C、A、B和A+B管，其中C管为生长对照，A管放入1张抗菌药物A药敏纸片，B管放入1张抗菌药物B药敏纸片，A+B管同时放入抗菌药物A和抗菌药物B药敏纸片，轻轻涡旋30 s，室温（23±2）℃孵育至少30 min使纸片中的抗菌药物完全扩散入肉汤中（不可超过60 min）（参考CLSI黏菌素肉汤纸片洗脱试验）。然后准备0.5麦氏浊度待测菌菌悬液，用移液器分别在在C、A、B和A+B管中加入10 μL的0.5麦氏浊度待测菌菌悬液，最终接种菌量为7.5×105 CFU/mL，35℃孵育16～20 h后观察各管中的细菌生长情况（图11）。注意：本方法每试管中肉汤的体积需按每片药敏纸片中所含抗菌药物的量和该菌对该抗菌药物的耐药判断标准而定，溶液中抗菌药物最终浓度应≥中介标准。如该菌对抗菌药物的耐药标准为≥16 mg/L，药敏纸片中所含抗菌药物的量为30 μg/片，则每管中CAMHB肉汤的含量应为2 mL。以纸片中抗菌药物完全溶解入肉汤中计算，2 mL肉汤中该抗菌药物的浓度为15 mg/L（近似于耐药标准）。
专家共识九：若C、A和B管中细菌均生长，但A+B管无细菌生长，报告抗菌药物A和抗菌药物B联合“存在协同作用”。
专家共识十：若C、A、B和A+B管中的细菌均生长，报告抗菌药物A和抗菌药物B“不存在协同作用”。
举例：如该菌为产金属酶肺炎克雷伯菌，抗菌药物A所含药物为头孢他啶-阿维巴坦，抗菌药物B所含药物为氨曲南。结果显示单药时细菌均生长，但两药联合后细菌生长被抑制，呈现协同抑菌或杀菌作用。（2）改良肉汤纸片洗脱法：此方法为单种抗菌药物增加剂量的试验。试验时在4根无菌试管中分别加入2 mL的CAMHB肉汤，分别标记为C、A、A×2和A×3，其中C管为生长对照，A管放入1张抗菌药物A药敏纸片，A×2管放入2张抗菌药物A药敏纸片，A×3管放入3张抗菌药物A药敏纸片，轻轻涡旋，室温孵育至少30 min纸片中的抗菌药物完全扩散入肉汤中（不可超过60 min）（参考CLSI黏菌素肉汤纸片洗脱试验）。然后吸取10 μL的0.5麦氏浊度待测菌菌悬液分别加入C、A、A×2和A×3管中，最终接种菌量为7.5×105 CFU/mL，35℃孵育16～20 h后观察各管中的细菌生长情况（图12）。注意：本方法每试管中肉汤的体积需按每片药敏纸片中所含抗菌药物的量和该菌对该抗菌药物的耐药判断标准而定，溶液中抗菌药物最终浓度应≥中介标准。如该菌对抗菌药物的耐药标准为≥16 mg/L，药敏纸片中所含抗菌药物的量为30 μg/片，则每管中CAMHB肉汤的含量应为2 mL。以纸片中抗菌药物完全溶解入肉汤中计算，2 mL肉汤中该抗菌药物的浓度为15 mg/L（近似于耐药标准）。 专家共识十一：若C和A管细菌均生长，但A×2和A×3管细菌均未生长，报告抗菌药物A增加剂量“存在协同作用”。 专家共识十二：若C、A、A×2和A×3管细菌均88生长，报告抗菌药物A增加剂量“无协同作用”。通过检测暴露于单药或联合药物不同时间段时的细菌存活数，评估不同药物间的协同或拮抗作用（图13）。协同通常定义为：与最具抗菌活性的单药相比，联合用药后细菌数呈≥2 log10CFU/mL级别的下降；拮抗通常定义为：与最具抗菌活性的单药相比，联合用药后细菌数呈≥2 log10CFU/mL级别的上升。
以出现协同作用为例，当采用金标准方法进行联合药敏试验时，若抗菌药物A和抗菌药物B两药呈现协同作用，可报告：抗菌药物A和抗菌药物B联合存在协同作用。当采用非金标准方法进行联合药敏试验时，若抗菌药物A和抗菌药物B两药呈现协同作用，可报告：抗菌药物A和抗菌药物B联合可能存在协同作用。专家共识十三：采用肉汤微量稀释棋盘法及纸条交叉法联合药敏试验，可根据FIC指数判断两药协同、相加、无关和拮抗结果。若采用其他方法开展联合药敏试验，仅根据结果报告两药是否存在协同作用。见图14、图15。
目前国际上无专用的联合药敏试验质量控制要求，建议可按照CLSI文件推荐的稀释法（MIC测定）或纸片扩散法的质控要求，规范联合药敏试验所涉及的稀释法和纸片扩散法等重要方法学的操作步骤、材料、试剂和质控菌株的要求进行质控，各实验室宜根据自己实验室的条件，针对所选择的联合药敏方法进行质量控制或性能验证，仅在所有涉及的联合药敏试验环节均在控的前提下，方可开展联合药敏试验。
来源：中国感染与化疗杂志2023年第23卷第1期
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