幽门螺杆菌对β-内酰胺类、大环内酯类、喹诺酮类抗生素的耐药机制

感染治疗离床医学

2024-08-28

幽门螺杆菌耐药机制概述

抗生素(antibiotic)是指由微生物（包括细菌、真菌、放线菌）或高等动物在生产过程中所产生的具有抑制或杀灭病原微生物的一类化学物质。临床上常用的抗生素主要来自微生物培养液中代谢产物的提取、化学合成或半合成的化合物。

抗生素按化学结构主要分为喹诺酮类抗生素、β-内酰胺类抗生素、大环内酯类、四环素类、氨基糖苷类抗生素等；按用途可分为抗细菌抗生素、抗真菌抗生素、抗肿瘤抗生素、抗病毒抗生素、畜用抗生素、农用抗生素及其他微生物药物等。

抗生素的抑菌或杀菌作用主要是针对“细菌有而人(或其他动植物)没有”的机制进行杀伤，其作用机制主要有四个：①抑制细菌细胞壁的合成；②增强细菌细胞膜的通透性；③干扰细菌蛋白质的合成；④抑制细菌核酸复制及转录过程。

临床上治疗H.pylori的主要抗生素包括：喹诺酮类抗生素、β-内酰胺类抗生素、大环内酯类、四环素类等。

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治疗H.pylori的常用抗生素及其耐药机制如下所示：

抗生素种类	代表药物	耐药机制	常见突变位点
β-内酰胺类	阿莫西林	青霉素结合蛋白结构的改变	PBP1、PBP2、PBP3
大环内酯类	克拉霉素	23SrRNA V区基因位点的突变	A2143G、A2142C、A2143
喹诺酮类	左氧氟沙星	gyrA基因QRDRQ的突变	Asn87Lys、Asp91Gly
四环素类	四环素	16S rRNA的点突变	AGA926-928发生单碱基或多碱基突变

注：PBP即青霉素结合蛋白。2.QRDR:喹诺酮耐药决定区

幽门螺杆菌的耐药机制：

(A) 导致青霉素结合基序内或周围氨基酸改变的突变导致β-内酰胺类（如阿莫西林）无法与改变的PBPs结合。因此，在β-内酰胺存在的情况下，细胞壁的合成继续进行，导致细菌对β-内酰胺产生耐药性。

(B) 23S rRNA结构域V特定区域的点突变导致大环内酯类（如克拉霉素）与50S核糖体亚基的结合受到抑制。因此，即使存在大环内酯，蛋白质的合成仍在继续，构成细菌对大环内酯的耐药性。同样，16S rRNA的突变阻止了四环素与30S核糖体亚基的结合。通过这种方式，细菌蛋白在四环素存在的情况下继续合成，表明细菌对四环素具有耐药性。

(C) 由于硝基还原酶(RdxA、FrxA和FrxB)的基因突变，硝基还原活性被抑制，硝基咪唑（如甲硝唑）前药未被激活为其功能形式。因此，细菌细胞对硝基咪唑类抗生素变得不敏感。

(D) DNA回旋酶(特别是QRDR)的突变阻止氟喹诺酮类药物(如左氧氟沙星)与靶位点的结合。因此，细菌DNA在氟喹诺酮类药物存在的情况下继续复制，导致细菌对氟喹诺酮类药物产生耐药性。同样，rpoB的突变导致RNA聚合酶的改变，阻止利福霉素(如利福丁)的作用，导致细菌对利福霉素产生耐药性。

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幽门螺杆菌对β-内酰胺类抗生素的耐药机制

β-内酰胺类抗生素是最安全、最有效、临床应用最广的一类抗生素，主要通过抑制细菌细胞壁的合成而起到抑菌作用，其主要药物包括青霉素类、头孢菌素类两大类，他们在结构上的共同特征是均含有β-内酰胺环，结构式如下所示：

一、代表药物

<一>、青霉素类

1.天然青霉素

主要指青霉素(pnicillin)

2.半人工合成青霉素

⑴、耐酸青霉素：

青霉素V(phenoxymethyl pnicillin)、芬贝西林(fenbenicillin)、菲那西林(phenethicillin)等。

⑵、内酰胺酶抗生素：

甲氧西林(methicillin)、双氯西林(dicloxacillin)、苯唑西林(oxacillin)、氯唑西林(cloxacillin)等。

⑶、广谱青霉素：

氨苄西林(ampicillin)、美坦西林(metampicillin)、酞氨西林(talampicillin)、阿莫西林（amoxicillin)等。

⑷、抗铜绿假单胞菌的广谱青霉素：

羧苄西林(carbenicillin)、卡那西林(carfecillin)、卡茚西林(carindacillin)、磺苄西林（sulbenicillin )等。

⑸、主要作用于革兰阴性杆菌的青霉素：

替莫西林(temocillin)、匹美西林(pivmecillinam) 、美西林(mecillinam)、福米西林(formidacillin)等。

<二>、头孢菌素类

1.第一代头孢菌素：

头孢唑啉(cefazolin)、头孢噻啶(cefaloridine)、头孢硫脒(cefathiamidine)、头孢拉定(cefradine)、头孢乙睛(cefacetrile)、头孢氨苄(cefalexin) 等。

2.第二代头孢菌素：

头孢孟多(cefamandole)、头孢呋辛(cefuroxime)、头孢克洛(cefaclor)、头孢尼西(cefonicid)、头孢替安(cefotiam)、头孢雷特 (ceforanide)。

3.第三代头孢菌素：

头孢唑肟(ceftizoxime)、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢曲松(ceftriaxone)、头孢他啶(cefazidime)等。

4.第四代头孢菌素：

头孢匹罗(cefpirome)、头孢吡肟(cefepime)、头孢唑兰(cefozopran)、头孢利定( cefclidin) 等。

<三>、其他β-内酰胺类

1.碳青霉烯类：

亚胺培南(imipenem)、塞西霉素(thienamycin)、帕尼培南 (panipenem) 、美罗培南(meropenem)、百阿培南(biapenem)。

2.头孢霉素类：

头孢替坦(cefotetan)、头孢美唑(cefmetazole)、头孢拉宗(cefbuperazone)、头孢西丁(cefoxitin)、头孢米诺(cefminox)。

3.单环β-内酰胺类：

氨曲南(aztreonam)、卡芦莫南(carumonam)。

4.氧头孢烯类：

氟氧头孢(flomoxef)、拉氧头孢(latanmoxef)。

5.青霉烯类：

法罗培南(faropenem)。

<四>、β-内酰胺酶抑制剂

包括棒酸(克拉维酸,clavulanic acid)、舒巴坦（Sulbactam）。

<五>、β-内酰胺类复方制剂

包括优立新、奥格门汀

二、β-内酰胺类抗生素的抗菌作用机制

β-内酰胺类抗生素主要是通过与细菌菌体细胞膜上的青霉素结合蛋白(penicillin binding proteins，PBPs)结合，抑制细菌细胞壁的合成，使菌体失去渗透屏障而膨胀、裂解，导致细菌死亡。PBPs是β-内酰胺类抗生素作用的靶蛋白，细菌有4-8种PBP，相对分子质量范围为35~40kDa。一般按相对分子质量降序命名，如PBP1、PBP2、PBP3、PBP4、PBP5 和PBP6。目前所知的绝大部分细都产生PBPs，不同种属的细菌含有PBPs的数量多少、相对分子质量大小以及对β-内酰胺酶的亲和力有所不同。此外β-内酰胺类抗生素还可借助细菌自溶酶溶解细菌，从而发挥杀菌作用。

三、幽门螺杆菌对β-内酰胺类抗生素的耐药机制

β-内酰胺类抗生素的耐药性主要涉及以下5种机制：

①、青霉素结合蛋白结构的改变产生的耐药性；

②、β-内酰胺酶产生的耐药性；

③、牵制机制产生的耐药性；

④、细菌外膜的屏障作用产生的耐药性；

⑤、细菌主动外排药物产生的耐药性。

阿莫西林是用于治疗H.pylori的β-内酰胺类抗生素的代表，具有价格便宜、杀菌能力强等优点，目前H.pylori对阿莫西林的整体耐药水平相对较低，是H.pylori较为理想的一线治疗药物。

国内外大多数研究认为，PBPs突变是导致H.pylori对阿莫西林耐药的最主要因素。在3种高相对分子质量的PBPs(PBP1、PBP2、PBP3)和6种低相对分子质量的PBPs中，被证实与阿莫西林耐药相关的PBPs分子是3种高相对分子质量的PBPs的突变，而PBP1蛋白的突变是阿莫西林耐药中最重要的。Dore等人在研究中发现，PBP-D蛋白在H.pylori对阿莫西林耐药中起着重要作用。Paul等人对阿莫西林产生耐药的H.pylori的PBPs进行分析时，在其中1株耐阿莫西林的H.pylori中可检测到PBPI和PBP2蛋白的突变。Rimbara等人比较13 株对阿莫西林耐药的H.pylori和3株对阿莫西林敏感的H.pylori的PBP1、2、3的氨基酸顺序，在前者分别检测到6个突变的PBP1、4个突变的PBP2和2个突变的PBP3，说明PBP1、2、3 的突变与阿莫西林对H.pylori 的耐药性相关，当他们对阿莫西林敏感的H.pylori进行转化时，发现PBP1和PBP3 的突变比PBP1和PBP2的突变或仅PBP1的突变对阿莫西林具有更高的耐药性。Qureshi等人的实验也证明，PBP1突变与阿莫西林的耐药性有关，其中三个氨基酸Ser414Arg、Thr556Ser和Asn562是PBP1最常见的变化形式。Tseng等人于2009年首次证明了H.pylori中β-内酰胺酶的产生与阿莫西林的高水平耐药相关，同时还证明PBP1基因的突变可使H.pylori对阿莫西林产生低水平的耐药。PBPs突变除了与H.pylori 对阿莫西林的耐药有关，膜通透性的改变也参与 H.pylori对阿莫西林的耐药过程。

幽门螺杆菌对大环内酯类抗生素的耐药机制

大环内酯类抗生素是一类在结构上含有14~16元大环内酯环的抗生素，常用药物有红霉素、阿奇霉素、罗红霉素和克拉霉素等。该类化合物对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和支原体等病原体具有较强的抗菌活性，如红霉素对治疗呼吸系统疾病中革兰氏阳性菌所致感染有较强的活性，但其所致的胃肠道反应也较重。其基本结构如下图所示：

一、代表药物

<一>、14元环抗生素，如红霉素(erythromycin)、克拉霉素(clarilhromycin)、罗红霉素 (roxithromycin)、喹红霉素(cethromycin)等。

<二>、15元环抗生素，如阿奇霉素 (azithromycin)。

<三>、16元环抗生素，如麦迪霉素(medecamycin)、螺旋霉素(spiramycin)、吉他霉素(kitasamycin)、乙酰吉它霉素(acetylkitasamycin)、罗他霉素 (rokitamycin)、交沙霉素(josamycin)和乙酰麦迪霉素(acetylmedecamycin)等。

第一代大环内酯类

红霉素（14元环）

乙酰螺旋霉素（16元环）

麦迪霉素（16元环）

吉他霉素（16元环）

交沙霉素（16元环）

第二代大环内酯类

克拉霉素（14元环）

罗红霉素（14元环）

阿奇霉素（15元环）

罗他霉素（16元环）

二、大环内酯类抗生素的抗菌作用机制

大环内酯类抗生素能够不可逆地与细菌核糖体50S大亚基相结合，通过阻断转肽作用及mRNA移位，选择性地抑制蛋白质的合成。现在相关研究者普遍认为大环内酯类可结合到50S亚基23SrRNA的特殊靶位，阻止肽酰基tRNA从mRNA的“A”位移向“P”位，这一过程使得氨酰基tRNA不能结合到“A”位进而选择性地抑制细菌蛋白质的合成。或与细菌核糖体505亚基的L22蛋白质相结合导致核糖体结构的破坏，使肽酰基tRNA在链延长阶段较早地从核糖体上解离下来。大环内酯类、林可霉素类和氯霉素类在细菌核糖体50S亚基上的结合位点相近或者相同，故合用时可能发生拮抗作用，也容易使细菌产生交叉抗性，所以不宜合用。由于细菌核糖体为70S，而哺乳动物核糖体为80S，因此，对于哺乳动物核糖体几乎无作用。

三、幽门螺杆菌对大环内酯类抗生素的耐药机制

细菌对大环内酯类抗生素的耐药机制可分为三方面：靶位的改变、灭活酶的产生和主动外排系统，靶位改变是主要耐药机制。

靶位的改变引起的耐药包括以下两种情况。第一种情况是甲基化酶对细菌23SrRNA的2058位腺嘌呤进行甲基化：大环内酯类耐药细菌的质粒和转座子上常常带有erm基因，该基因能编码甲基化酶，编码的甲基化酶能以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，对细菌23SrRNA的2058位腺嘌呤进行甲基化修饰，使50S亚基单位和药物的亲和力下降，从而产生耐药；第二种情况是23SrRNA或核糖体蛋白的突变：23SrRNA的A2058及其附近区域的突变也可以引起耐药，而核糖体蛋白在大环内酯类耐药机制至今并未确定。

克拉霉素是目前用于根除H.pylori的大环内酯类药物代表。根据最新的Maastricht V共识指南，如果当地克拉霉素耐药率大于15%，则不推荐使用克拉霉素进行治疗。近年来，H.pylori对克拉霉素耐药性的增加，是导致H.pylori根除失败的主要原因。克拉霉素对H.pylori的耐药机制较为明确，主要由23SrRNA V区上的点突变所致，但是关于H.pylori 23SrRNA点突变的位置的两个位置计数不一致，包括:A2058和A2059，A2154和A2515，A2142和A2143，A2143和A2144 等。

1996 年，Versalovi等人首次发现了H.pylori 23S rRNA V区上的A-G的点突变，导致大环内酯类抗生素与核糖体的结合能力下降，从而赋予H.pylori耐药性。随后Occhialini等人的研究也证实了23SrRNA V区上的点突变是导致H.pylori对大环内酯类抗生素产生耐药的主要原因。

H.pylori具有两个拷贝的编码23SrRNA的基因，两个拷贝基因中其中一个拷贝基因发生突变可导致大环内酯类药物产生耐药，其中突变较多的是2142或2143的腺嘌呤被鸟嘌呤或者胞嘧啶所取代，记为A2142G/C和A2143G/C。Megraud的一项回顾性调查发现，采用测序或者聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)对23SrRNA点突变行检测，发现23SrRNA最常见的突变是A2143G(69.8%)，其次为A2142G (11.7%)和A2142C (2.6%)，A2142C 突变率较低的原因可能是大多数研究没有使用相关的限制性内切酶来检测它；而Abadi等人则证明伊朗地区H.pylori对克拉霉素耐药主要由A2143G突变引起，其突变比例为93.7%。除了A2143G和A2142G的点突变外，也有研究表明H.pylori对克拉霉素的耐药也可由A2142C的突变引起。

不同的23SrRNA 突变类型，可引起H.pylori对大环内酯类抗生素的不同耐药水平的变化，其中2142位置菌株的突变较2143位置的突变有较高的MIC水平。正如Garcia Arata等人所报道的一样，含有A2143G突变的H.pylori，其克拉霉素的MIC为0.016ug/ml~256ug/ml；2142突变位置突变的所有菌株(A2142G/C)中克拉霉素的MIC均大于256ug/ml；A2143G突变的菌株则有较大的MIC范围，提示突变可能涉及一个或两个23SrRNA操纵子，也有可能是由其他的耐药机制所引起。其他耐药机制，如灭活酶的产生主动外排系统、膜渗透性的下降机制尚未明确，可通过基因测序的方法检测H.pylori的基因序列来判断。

幽门螺杆菌对喹诺酮类抗生素的耐药机制

喹诺酮类抗生素是应用广泛的人工合成抗菌药物，其结构中含有4-喹诺酮双环，在其侧链上引入不同的基团可影响该类药物的抗菌谱、脂溶性和不良反应等，药物不良反应较少，对革兰阴性菌和革兰阳性菌均具有较强的抗菌活性。其结构式如下图所示：

一、代表药物

<1>、第一代喹诺酮类，包括萘定酸(nalidixic acid)、奥索利酸(oxolinic acid)和吡咯米酸(piromidic acid)等，为窄谱抗菌药，主要作用于革兰阴性菌，对革兰阳性菌和铜绿假单胞菌无活性，不良反应多，临床应用效果一般。

<2>、第二代喹诺酮类，包括吡哌酸(pipemidic acid)和西诺沙星(cinoxacin)等，主要作用于革兰阴性菌，对铜绿假单胞菌和革兰阳性菌有一定的作用。

<3>、第三代喹诺酮类，又称氟喹诺酮类，主要包括环丙沙星(cipronloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、氟罗沙星(fleroxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)、培氟沙星(Peloxacin)和诺氟沙星(nornoxacin)等。此类药物不仅改善了DNA旋转酶的抑制活性，还提高了其抗菌活性，拓宽了抗菌谱，对革兰阴性、阳性菌和非发酵菌都有作用，副作用较小。

<4>、新喹诺酮类，包括左氟沙星(Levofloxacin)、曲伐沙星(trovafloxacin)、格帕沙星 (grepafloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、格替沙星(gatifloxacin)、加替沙星 (gatifloxacin)、吉米沙星(gemifloxacin)、加雷沙星(garenoxacin)等。它具有抗菌谱更广、作用更强的特点，有超广谱喹诺酮类药物之称。

二、喹诺酮类抗生素的抗菌作用机制

<一>、抑制DNA旋转酶

DNA旋转酶为喹诺酮类抗生素抗革兰阴性菌的重要靶点。DNA在转录或复制过程中其双螺旋结构部分打开，同时引起解螺旋附近的双螺旋结构过度缠绕，形成正超螺旋，这将阻碍双螺旋结构的进一步打开，使转录或者复制过程难以继续。一般认为喹诺酮类是通过作用于DNA旋转酶的A亚基发挥抗菌作用，但二者并不是直接结合，而是喹诺酮类与酶和DNA形成复合物后抑制DNA旋转酶的切口活性和封口活性，从而达到灭菌的目的。

<二>、抑制拓扑异构酶IV

拓扑异构酶Ⅳ是喹诺酮类药物抗革兰阳性菌的重要靶点。细菌在复制过程中常形成环连体等异常DNA结构，拓扑异构酶Ⅳ具有解环连体和松弛超螺旋等生理作用，可修复DNA复制过程中产生的异常结构。喹诺酮类通过干扰细菌DNA复制过程发挥抗菌作用。

喹诺酮类抗生素可能还存在其他机制，如诱导菌体DNA的SOS修复功能，出现DNA错误复制而导致细菌的死亡。喹诺酮类在抗菌时具有抗生素后效应，抗生素后效应持续时间的长短与喹诺酮类药物的血药浓度呈正相关。

三、幽门螺杆菌对喹诺酮类抗生素的耐药机制

细菌对喹诺酮类药物的耐药机制分为特异性和非特异性两类。特异性耐药机制有拓扑异构酶氨基酸顺序的突变和耐药性质粒的出现，导致药物作用靶位的改变，使药物不能对其产生作用；非特异性耐药机制包括细菌外排系统表达水平和膜通透性的改变，使药物的主动外排增加和(或)内流减少。

喹诺酮类耐药有以下几个特点：

①、耐药可以发生在染色体上，质粒介导的耐药性近年来也有报道，应对其给予重视；②、耐药基因gyrA会在一个很小范围内突变，这个范围被称为喹诺酮耐药决定区(quinolone resistance-detemining region,QRDR)；

③、喹诺酮类药物之间存在广泛的交叉耐药，有些还与其他药物存在交叉耐药。迄今为止，尚未发现灭活酶介导喹诺酮类药物的耐药机制。

H.pylori对喹诺酮类药物的耐药机制主要与gyrA基因QRDR的突变有关。DNA旋转酶由gyrA和gyrB基因编码，而parC和parE基因编码拓扑异构酶IV，未发现parC和parE基因突变参与H.pylori的耐药过程。细菌对氟喹诺酮类的主要耐药机制是通过干扰细菌旋转酶的活性从而干扰细菌DNA的复制，氟喹诺酮类对H.pylori的耐药主要是影响DNA旋转酶的A亚单位，由gyrA基因的喹诺酮耐药决定区(QRDR)点突变引起，其中点突变最常涉及gyrA中第 87位(Asn87Lys)和91位(Asp91Gly，Asp91Asn，Asp91Tyr)氨基酸的替换。Rimbara等人发现，gyrA基因上87位(Asn87Lys)较91位(Asp91Asn)氨基酸位点的替换赋予氟喹诺酮类药物更高的抗性。Rhie等人首次报道了gyrA基因第85位(Gly85Cys)氨基酸的替换参与了氟喹诺酮类药物的耐药性，这一发现说明在氟喹诺酮类药物增加的时代，H.pylori可能会对氟喹诺酮类药物产生一些新的耐药机制。但gyrB基因的突变与氟喹诺酮类药物的耐药性仍然存在一定的争议，Rhie认为gyrB基因的突变与耐药性无关，而Rimbara等人则认为gyrB基因463氨基酸的位点突变显示出对氟喹诺酮类药物的抗性，可以作为对氟喹诺酮类药物新的耐药机制。

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