高通量测序技术在肺真菌病诊断中的研究进展
高通量测序技术在肺真菌病诊断中的研究进展
据2022年WHO发布的威胁健康的真菌清单，侵袭性真菌疾病的患病率及病死率总体呈上升趋势[1]。侵袭性真菌疾病是指真菌侵入人体，在组织、器官或血液中生长、繁殖，并导致炎症反应及组织损伤的疾病[2]。肺是侵袭性真菌疾病常见的感染部位之一[3,4]，肺真菌病是由真菌引起的支气管和肺部的真菌炎症或相关病变。近年来，随着广谱抗生素、免疫抑制剂、肿瘤化疗药物的广泛使用以及器官移植患者的增多，再加上获得性免疫缺陷综合征在全球流行的加剧，真菌感染的发病率和病死率逐渐增加。目前，肺真菌病的常用检测方法包括病原学、组织病理学、血清学、影像学及分子生物学等方法，但现有的方法难以满足临床需求。高通量测序(next-generation sequencing，NGS)技术可以通过对临床样本中微生物和宿主核酸的测序分析，实现对病毒、细菌、真菌和寄生虫的通用病原体检测[5]。因此，该技术在临床上得到了广泛应用。本文对NGS在肺真菌病诊断中的研究进展进行探讨。
非培养技术在非移植、非粒细胞缺乏的重症患者真菌感染诊断中的应用
一、NGS技术与病原体检测
1977年，使用第一代Sanger测序技术成功完成了噬菌体phi X174 DNA的全基因组测序，这标志着基因组测序技术历史上的第一次成功[6]。随着时间的推移，NGS技术(也称为下一代测序技术或二代测序技术)得到了广泛应用。这种技术可以同时读取数十万到数百万条DNA分子序列，显著改善了第一代测序技术相关的低通量问题。
NGS过程主要包括实验操作和生物信息学分析2个部分。实验操作包括样品预处理、核酸提取、文库构建和测序；而生物信息学分析则包括数据的质量控制、人类序列的去除、微生物物种序列的比对，以及耐药性或毒性基因的分析[2]。在NGS中，基本单位是"读取长度"，它反映了测序反应中给定单个DNA分子中核苷酸的顺序，单个读取的长度通常在数十个核苷酸到超过10万个核苷酸之间[3]。
目前，NGS在微生物实验室中的应用主要包括靶向基因测序和宏基因组下一代测序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)。靶向基因测序主要包括基于引物PCR扩增的扩增子测序和基于探针杂交的杂交捕获测序[2,4]，可用于核酸序列已知的病原体检测，并在识别疾病序列变异方面具有高敏感度和特异度。而mNGS通过对临床样本的DNA或RNA进行鸟枪法测序，可实现对病毒、细菌、真菌和寄生虫的通用病原体检测，具有检测范围广泛、耗时短等优点[5]。多项研究表明，相比传统检测方法，mNGS具有更好的阳性率[7,8,9,10]。NGS技术于2014年在临床应用方面获得突破[11,12]，自此以后，mNGS技术被广泛应用于病原体诊断，并在疾病监测、病原体发现、病原体流行病学研究等方面展现出广阔的应用前景。目前NGS技术在其实验操作和生物信息学分析过程中仍存在一些技术困难需要克服和标准化问题亟待解决。
二、真菌特点与常用检测方法
真菌是一类广泛存在于自然环境中的真核微生物，可能导致机会性感染。免疫抑制或患有严重疾病的患者更容易并发肺真菌病，如癌症、艾滋病、初发结核病后感染、器官移植和慢性呼吸道疾病等。然而，正常人群的患病率也在逐渐上升[1]。
真菌的细胞壁是一种特有的结构，其中一些组分具有很强的免疫原性，因此在感染期间可以刺激机体发生细胞和体液反应，这些组分是非常重要的病原体生物学标志物[13]。1，3-β-D葡聚糖抗原检测(G试验)、半乳甘露聚糖抗原检测(GM试验)和隐球菌荚膜多糖抗原检测等血清学检测方法就是基于真菌细胞壁的这些特性发展而来。其中，G试验常用于检测怀疑肺真菌病(除隐球菌病或毛霉病)患者，因为曲霉菌、念珠菌等可以在体内感染时产生1，3-β-D葡聚糖，而隐球菌属或毛霉目真菌则不会产生。欧洲癌症治疗研究组织/真菌研究组共识也将G试验作为诊断侵袭性真菌感染的间接微生物学标准之一[14]。半乳甘露聚糖是曲霉菌细胞壁上主要的多糖成分，在曲霉菌侵犯组织早期就可释放入血，因此血清GM试验常用于侵袭性肺曲霉病的早期检测[15]。此外，隐球菌在菌体生长和繁殖过程中会生成荚膜多糖，血清隐球菌荚膜多糖抗原检测常用于隐球菌病的筛查，也可用于肺隐球菌病患者的病情监测及预后判断[16,17]。
传统的真菌病原学检测方法包括涂片法和培养。涂片法是临床上最常用的快速、简便的真菌检测方法，该方法通过对临床样本进行涂片和染色，然后在显微镜下直接观察样本中有无菌丝及孢子，并通过其菌丝和孢子的形态、大小、排列方式等初步鉴别出种属。但是，当肺部真菌负荷低时，涂片法敏感性较低，通常需要多次检测才能提高检出率。真菌培养是肺真菌病的重要检测手段，但需要较长的培养时间，通常3～7 d，有时更长(特殊情况如组织胞浆菌的培养需要2～4周以上)。真菌培养会受到多种因素的影响，如温度、湿度、pH值等。真菌在冷藏或制备组织匀浆时可能受到损伤，取样前的抗菌治疗也可能影响培养结果[18]。由于真菌培养条件苛刻、周期长、阳性率低，因此极易延误疾病的诊断和治疗。此外，真菌培养阳性难以鉴别定植和感染，取样也难以避免杂菌污染[15]。例如念珠菌常在口腔定植，肺部感染很少见，通过纤维支气管镜取样时极易带入口腔定植菌而导致假阳性结果。当真菌培养阳性时，需结合患者危险因素、临床表现和其他指标综合判断。
近年来，分子生物学检测方法如聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)、质谱技术等已广泛应用于病原微生物的诊断。真菌特异性PCR引物和实时荧光定量PCR扩增物已被用于多种真菌感染的诊断[19]。虽然使用PCR技术进行免疫分析和核酸检测可以快速、准确地鉴定病原体，但需要对病原微生物类型有一定了解或预先假设[14,20]，这极易导致漏诊情况的出现。基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱分析是一种新兴的微生物鉴定技术，其操作简单，准确性高，为真菌的鉴别和诊断提供了新的选择。然而，由于样本处理方法和真菌临床数据库的局限性，该技术应用于临床仍需要进一步探索[21,22,23,24]。
肺真菌病的影像表现非常多样化，包括结节、肿块、节段性或亚节段性实变、肺不张、磨玻璃样阴影、树芽状、空洞或胸腔积液等。尽管这些影像表现在一定程度上具有典型性，但并不具有特异性，因此影像学检查只能作为诊断肺真菌病的辅助手段。高分辨率CT扫描对肺真菌病的检测优于胸片、磁共振成像和PET/CT，是首选的影像学检测手段[23,24]。在某些高危人群如恶性血液系统疾病或肺移植患者中，高分辨率CT扫描可能发现晕征、低密度征和空气新月征等，这些影像特征有利于鉴别曲霉菌感染和非真菌肺炎[24,25]。此外，在进行治疗监测时，影像学检查也可以作为评估疗效的重要指标之一。
组织病理学是诊断肺真菌病的"金标准"，其病理特征为化脓性肉芽肿或结核样肉芽肿。然而这些特征与结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌及某些寄生虫感染相似，需要进行特殊染色来提高检出率，如六胺银染色、过碘酸-希夫染色、印度墨水染色、钙荧光白染色可以突出真菌，而齐-内染色可以区分抗酸微生物[23,26]。组织病理学诊断需要有创操作来获取组织样本，部分患者可能无法耐受活检的并发症，有些病灶部位也难以获得组织样本，这些因素都限制了组织病理学在临床中的应用。
三、NGS检测肺真菌病
内部转录间隔区是真菌核糖体RNA基因非转录区的一部分，具有高度序列多样性，常用于NGS真菌测序。不同类型的内部转录间隔区引物倾向于不同类型的真菌，临床上常用于真菌的靶向测序[19,27]。虽然多项研究表明mNGS对真菌检测具有比常规检测方法更好的阳性率[7,8,9,10]，但其特异度和准确度相对较低[28]，可能由于NGS无偏倚地检测样本中所有DNA，导致假阳性率较高。此外，真菌的基因组较大，细胞壁通常难以溶解，限制了DNA的释放及其随后的扩增和测序[29]。虽然一些物理手段如玻璃珠技术可以破碎真菌细胞壁，有利于释放细胞内物质，但也会导致真菌的DNA或RNA产生损伤或降解[30]，因此其检出的特异序列数仍然受限。为了提高测序的准确性，临床上常根据一定的阈值过滤检测结果，但阈值缺乏统一的标准。
如何准确地鉴定定植菌和致病菌、避免环境中污染真菌的干扰是NGS检测真菌亟待解决的问题。研究表明，肺部真菌群落的结构和多样性在不同人群(健康人群和患病人群)之间存在差异，这可能与疾病的发生和发展有关。真菌与其他微生物如细菌和病毒之间的相互作用也可能是影响宿主免疫反应和炎症反应的因素之一[30,31]。Chen等[32]通过对心脏术后肺部感染患者的痰标本进行常规培养和mNGS分析，建立了肺部微生物丰度检测限值的参考目录，用于评估标本中单个微生物的致病风险，以区分临床标本中的致病菌株和定植菌株。同样，Zhang等[33]通过NGS建立了一个定植微生物数据库，包括健康人群不同部位的常见定植微生物的相对丰度范围。如果检出微生物相对丰度高于阴性对照，并超出数据库中的正常范围，则认为它可能是一种致病病原体。因此，通过NGS对肺部微生物进行测序，了解微生物群落的组成和功能，可以进一步揭示肺部微生物群落与疾病的关系，从而帮助临床疾病的诊疗[34,35,36,37]。
在免疫功能受损患者和重症肺炎患者中常见多种病原体感染。然而，由于不同病原体染色方法存在差异，可能导致涂片法和组织病理学方法出现漏诊；而培养法也可能受到培养条件、培养周期、抗生素使用等因素的影响而出现结果偏差。相比之下，mNGS作为一种无偏倚检测手段，在诊断混合感染中具有更高的诊断效能。一项针对72例呼吸机相关性肺炎患者的研究结果表明，采用mNGS方法检测肺泡灌洗液，混合感染的检出率为55.6%，真菌检测的敏感度为71.9%，特异度为77.5%[38]。另一项针对235例疑似肺炎患者的研究表明，mNGS比常规培养法检出更多的混合微生物感染(34.09%比5%)，对真菌检测的敏感度达到80.43%[39]。因此，mNGS在诊断混合微生物感染中具有优势，可以提高准确性和检出率，为临床治疗提供更精准的依据。
NGS技术在临床上也被用于疑难、罕见真菌的诊断。一些真菌主要存在于特定地理分布区域，但随着全球经济和交通的发展，这些真菌感染病例在其他地区也逐渐增多，如耶氏肺孢子菌[40]、组织胞浆菌[41]、马尔尼菲蓝状菌[42]等。这些真菌通常是机会性致病菌，感染后无特异性临床表现，严重并发症较多，若未早期诊断和治疗，病死率极高。NGS能快速、精准地检出罕见真菌，为患者的早期诊断、治疗以及阻断传播提供了可能。
四、总结与展望
近年来，肺真菌病的发病率和病死率不断攀升，早期、准确地识别病原体和确定有效的治疗方案对改善患者的预后至关重要。NGS检测具有高阳性率和耗时短的优势，在肺真菌病的诊断中起着重要作用。NGS技术不仅可以检测肺部真菌群落，还能识别多重感染，发现罕见的病原体，有利于肺真菌病的早期治疗。但是，NGS技术还存在一些局限性，例如检测结果中阈值标准的不统一性，定植菌和环境中杂菌的干扰，以及真菌细胞壁对DNA提取的阻碍等。因此，未来需要开展高质量的NGS临床研究，进一步完善和提高NGS技术，使NGS的结果更加准确，成本效益更高，以便在临床应用中发挥更大的作用。
引用: 张丹丹, 兰箭. 高通量测序技术在肺真菌病诊断中的研究进展 [J] . 国际呼吸杂志, 2024, 44(2) : 143-147.