"分枝杆菌世界的变形者"：谈谈脓肿分枝杆菌形态转换机制
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脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus，MAB)是我国乃至世界范围内致病性快速生长型非结核分枝杆菌中最常见的菌种[ 1 , 2 ]，也是具有高度耐药性的机会性致病病原体。免疫缺陷者易发病，可引起皮肤、软组织、淋巴结、骨骼以及肺部等部位感染[ 3 ]，尤其是肺囊性纤维化、慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张症、实体器官移植接受者和其他慢性肺部疾病患者感染风险较高，经久不愈[ 4 , 5 , 6 , 7 ]。MAB存在平滑(Smooth，S)型或粗糙(Rough，R)型两种菌落形态。S型形成的生物膜能抵御高温和高氯含量的液体，使其能在生活用水中存活[ 8 , 9 ]，而慢性肺部疾病患者黏液纤毛清除功能受损是S型造成肺部感染的易感条件[ 10 , 11 ]。早在1999年有文献报道了由单一亲本MAB菌株产生的S和R型，R型持续存在于严重综合免疫缺陷病小鼠的肺中，可在巨噬细胞中复制，并在成纤维细胞层中形成有绳索样结构的侵袭性微集落，S型则没有这些特征[ 12 ]。后从肺囊性纤维化患者的纵向分离株中观察到了S向R型的转变，并伴随临床症状的加重[ 13 , 14 ]。
R型MAB能形成绳索，躲避宿主的细胞内杀伤[ 15 , 16 ]，有利于MAB在宿主体内持续存活和复制[ 17 ]，促进更多促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8等释放[ 16 , 18 , 19 , 20 ]，导致更严重的肺部炎症反应[ 18 ]。因此，R型被认为是从S型中产生的新形态，主要产生在与宿主相互作用的过程中[ 14 , 21 ]，正是由于MAB的不同形态导致了不同生物学功能和致病性，如滑动运动或生物膜形成、与宿主细胞相互作用、巨噬细胞的细胞内运输和毒力等[ 22 , 23 ]。此外，还有研究表明，MAB的形态不同，对不同抗菌药物的敏感性也是不同的，S型更容易在存在肺部基础疾病患者的肺内定植下来，导致发病，而R型则导致治疗周期延长、病程迁延不愈、疾病复发率高和病死率增加、治愈率下降，严重影响了患者的生存质量。因此研究MAB形态转换对认识和了解MAB的致病机制以及病原-宿主互作关系是非常重要的。
MAB形态转变机制
虽然基因从一个环境到另一个环境有可能因为偶发突变而发生改变，但基因型通常还是保持不变，然而生物体仍可以产生不同且广泛的表型。这种由环境对调控性状基因的表达和功能的影响导致的表型变异，而不是基因突变产生的表型变异被称为基因型-环境相互作用(Genotype-environment interaction，GEI)[ 24 ]。这种差异是生物体对周围环境做出的反应，尤其是在异质或新环境中，它是生物体探索适应新环境的一种能力，对其存活至关重要。细菌形态作为其生物表型的一种，也是由多个基因与多个环境变量相互作用决定的。目前对导致MAB形态变化机制已有较多报道，大致可以归为以下两类：(1)表型可塑性，是指生物基因型响应环境条件变化表现出替代形态、行为和生理特征的能力[ 25 ]。表型可塑性对在自然界中观察到的生物表型多态性起到至关重要的作用[ 25 ]。目前的研究中，已经发现有3种环境条件的变化可能对MAB的表型可塑性产生影响。(2)基因变异和基因改造，调控MAB形态的基因偶发突变导致的基因表达和功能改变有利于MAB在新环境尤其是宿主体内生存，从而使这种偶发突变和表型被保留了下来，并稳定地遗传给下一代[ 26 ]。另外，研究人员运用基因工程技术对MAB的基因组进行改造来研究基因功能，这也是获得表型稳定的基因突变菌株的一种方式，虽然这些被改造的菌株只有极少感染人类的机会。
1 环境因素与MAB的表型可塑性
1.1 环境的抗生素压力
Tsai等[ 27 ]对MAB的S型菌株进行抗生素纸片扩散试验，发现阿米卡星对MAB的最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration，MIC)为2 μg/mL，阿米卡星浓度在0.03~1 μg/mL的区域生长出R型菌落，在<0.03 μg/mL的区域菌落呈S型，把R型菌株接种到不含阿米卡星的琼脂平板上后细菌又恢复了S型。作者将阿米卡星的0.03~1 μg/mL浓度区间定义为亚抑制浓度(sub-MIC)。此外，他们还发现与无阿米卡星培养基相比，在阿米卡星亚抑制浓度下，GPL基因簇基因的表达没有改变，细胞壁GPL成分的含量也没有变化，但MAB的滑行能力降低，聚集和粘附能力、条索形成能力增强，也增强了MAB的抗吞噬能力和促进TNF-α分泌。
Lee等[ 28 ]也发现了sub-MIC的阿米卡星可以导致MAB从S型向R型转换，在细菌的排列和聚集、滑行能力及促进TNF-α分泌等方面的结果与Hurst-Hess等[ 29 ]一致，但是他们发现sub-MIC的阿米卡星可以降低GPL合成相关基因的转录水平，在R型中，fadD23、gap-like和sap相关的长链脂肪酰基amp连接酶、GPL产生和GPL转运调控基因的RNA水平均降低，但未进一步解释引起这种表达差异的具体机制。
1.2 环境温度
Rhoades等[ 30 ]研究发现，临床分离的MAB粗糙型菌落(390R)在37 ℃培养时表现为R型，在23 ℃培养时可转换为S型，但其同基因来源的390S(传代培养时分离到的S型)和390V(390S传代过程中的R型回复体)却仍保持自身的特有表型。并通过质谱分析发现，在23 ℃培养时，390R变体完整表达GPL分子，当细菌在37 ℃下生长时，GPL分子不再表达，且随着温度升高，390R逐渐失去表达GPL的能力。对于引起此改变的分子机制，作者未进一步说明。
1.3 环境营养条件
Nandanwar等[ 31 ]在进行MAB培养时偶然发现，MAB在含ADC的7H9琼脂平板上生长出S型菌落，在LB琼脂平板上却生长出R型菌落。把ADC的成分之一牛血清白蛋白加入到LB培养基中，可以导致MAB出现一些中间S型。当在LB中只加入ADC的另外两种成分葡萄糖或过氧化氢酶，或者在LB和牛血清白蛋白的基础上加入葡萄糖或过氧化氢酶，都不会出现S型或中间S型的MAB菌落。作者未对引起该变化的机制作进一步阐释。
2 基因变异和基因改造与MAB的形态转换
2.1 GPL基因座
Sondén等[ 32 ]对超过19 000个插入突变体文库进行CR结合测定，并结合生物信息学分析，表征了一个约60×103 bp的区域，即GPL基因座，该区域包含编码两种非核糖体肽合成酶的基因(mps1和mps2)，一种完整的膜蛋白(mmpL家族成员)，一种甲基转移酶，一种聚酮合酶，一种参与GPLs生物合成的酰基转移酶蛋白和另一种完整的膜蛋白Gap。进一步对耻垢分枝杆菌的gap进行敲除、转座子诱变及回补等，进行刚果红染色、薄层层析和钌红染色等方法对野生菌株和突变菌株的细胞内外GPL进行检测，证明了gap是一个新的分枝杆菌特异性转运蛋白家族，参与了GPL的转运。
Howard等[ 33 ]报道了GPL负责S型的形成并调控滑动运动和生物膜形成能力，同时证明了缺乏GPL会使MAB从S型中自发产生R型突变体。Pawilk等[ 34 ]运用比较基因组学和转录组学等方法，分析3对同基因型的S和R菌株的全基因组序列，发现GPL基因座内有多个插入突变或单核苷酸多态性，其中非核糖体肽合酶基因簇(mps1-mps2-gap)或mmpl4b中的独立小插入或缺失突变同时出现在R型中，转录组分析发现R型中GPL基因座表达显著下调，过表达mps1基因证实了R型中4160403-4位置的CG插入导致了mps1-mps2-gap操纵子的转录停滞，因此认为GPL基因座变异是产生R型的主要机制。Chhotaray等[ 35 ]对R和S型菌株进行全基因组甲基化分析，发现msp1和msp2在S型中的甲基化程度高于R型，但是gap不存在甲基化修饰，认为GPL基因座中甲基化模式的差异可能是两种菌株中msp1和msp2基因表达差异的原因。Dedrick等[ 36 ]分析S与R型临床分离株被噬菌体感染后的存活情况，并运用基因组测序技术等证实了粗糙型菌落是由糖肽脂合成基因mps1和mps2中的插入缺失引起的。这些基于组学方法的研究证明了msp1和msp2在合成GPL中的作用，它们的存在与否以及功能是否正常是导致MAB形态是否相同的重要因素。
在2010年之前，mmpL4a、mmpL4b、mmpS4等基因的功能并未研究清楚，仅推测它们可能与GPL生成有关，因此Nessar等[ 37 ]运用S型MAB构建mmpL4b缺失菌株，发现mmpL4b缺失菌株与R型菌株形态一致，从而证实了通过删除S变体mmpL4b基因而使其失去GPL表达并表现出粗糙表型，并推测该基因编码对GPL表达至关重要的膜蛋白，具体功能有待考究。Park等[ 38 ]对9例支气管扩张症或肺囊性纤维化患者追踪随访8~12年，共分离出50株MAB临床分离株(S型11株，R型39株)，对所有菌株进行全基因组测序并分析GPL基因座中mps1、mmpL4b、gap、mps2，mtbH，mmpS4、fmt和mmpL4a的突变信息，发现这8个基因在S型分离株均没有突变，39株R型中有35株(90%)存在突变，范围从单碱基插入或缺失到长达3.1×103 bp跨基因的碱基缺失，77%的R型菌株存在mps1和mps2基因突变，13% R型菌株的mmpL4a和mmpS4基因突变之前鲜见报道。Bernut等[ 39 ]对MAB的S和R型菌株进行基因组测序分析发现R型变体中存在一个T2524C的单核苷酸突变，该位置的酪氨酸被组氨酸取代，并通过功能性mmpl4a回补及薄层层析等实验证实了该位点的突变是导致MAB糖肽脂产量损失的原因，并推测它可能作为脂质转运蛋白参与了GPL的转运。Viljoen等[ 40 ]通过构建MAB的mmpL4a、mmpL4b和mmpS4基因敲除及回补菌株，证实了S型菌株mmpL4a、mmpL4b和mmpS4基因的缺失可以导致GPL转运障碍而表现出R表型，这些研究为进一步探索GPL基因簇中mmpL4a、mmpL4b和mmpS4基因与MAB形态的关系提供了有力证据，证明了mmpL4a、mmpL4b和mmpS4基因功能的缺陷和缺失导致GPL转运障碍，细胞壁合成受阻，从而导致MAB表现出R表型。
Daher等[ 41 ]通过对GPL基因座中糖基化酶基因gtf1、gtf2和gtf3进行不同的敲除、回补及过表达组合，观察菌落形态、生物膜形成、GPL含量检测、感染巨噬细胞和斑马鱼并进行共聚焦分析等试验，发现gtf1和gtf2对GPL糖基化有重要作用，保持GPL糖基化可以影响分枝杆菌细胞表面的亲水性，维持S菌落形态型，促进巨噬细胞中更高的细菌负荷，减弱斑马鱼体内的Mab毒力。
尽管GPL基因簇最早并非在MAB当中被发现的，但是它在分枝杆菌中具有高度的保守性和同源性[ 22 , 32 ]，关于MAB表型差异与GPL基因簇中各基因之间的关系已经被大量研究证实，并进行了很好的总结[ 22 , 42 ]，mps1和mps2主要合成非核糖体肽合酶，参与GPL三肽-氨基醇合成，gtf3合成糖基合成酶，参与GPL鼠李糖合成，而gtf1和gtf2合成糖基化酶，对GPL进行糖基化修饰，gap、mmpL4a、mmpL4b和mmpS4则主要参与了GPL的转运。详见 表1 。从这些广泛的研究可以看出，GPL与MAB形态转换的关系是非常明确的，当然，可能还存在其他尚未被观察到的机制，有待进一步研究。
2.2 MAB_3083c
Liu等[ 43 ]通过对MAB临床分离株构建转座子突变库，进行转座子诱变获得MAB_3083c∷Tn突变株，其菌落形态从R变为S型，将MAB_3083c回补到MAB_3083c∷Tn突变体中后发现该回补菌株恢复了R形态。虽然光滑型的MAB_3083c∷Tn突变体具有更高的运动性和更低的聚集能力，但是3种菌株的GPL表达谱没有显著差异。根据生物信息学分析，MAB_3083c被推定为核糖核酸酶RNase J[ 43 ]，其作用是调节mRNA的稳定性和核糖体RNA的成熟[ 44 , 45 , 46 ]。在化脓性链球菌中，RNase J1和RNase J2都是必需的[ 47 ]，而在枯草芽孢杆菌[ 48 ]和委内瑞拉链霉菌[ 49 ]中，RNase J的敲除会影响他们的孢子形成与成熟、导致核糖体组装缺陷以及细胞外观改变。因此MAB_3083c可能通过影响MAB菌落形态、滑动能力，以及聚集能力相关mRNA的稳定性，从而导致相应的蛋白或酶类合成或修饰障碍，进而影响MAB的形态，但尚未鉴定出与这些表型相关的mRNA的基因。
2.3 MAB_3168c
Tsai等[ 50 ]通过建立MAB转座子突变文库，筛选可以引起MAB形态改变的突变体。其中MAB_3168c∷Tn可使R型的野生型转变为S型，将MAB_3168c回补到突变体中后，菌株部分恢复粗糙形态。qPCR检测发现MAB_3168c∷Tn不表达MAB_3168c基因，回补菌株MAB_3168c的表达水平仅为野生株的60%。通过薄层层析观察到野生株和MAB_3168c∷Tn的GPL合成并没有差异，仅通过生物信息学方法推测其为GCN5相关N-乙酰转移酶。尽管如此，他们的研究证明了MAB_3168c是可以调控MAB的表型转换的，但不是通过影响GPL的合成或转运这一经典途径，而有可能是影响了其他细胞壁成分的合成，不过文章并未进一步介绍。
2.4 MAB_3508c
Tsai等[ 27 ]通过对亚抑制浓度下同一基因型MAB菌株的S和R型的转录组学数据进行分析，并进行qPCR验证，发现MAB_3508c在R型菌株中高表达，并通过构建MAB_3508c过表达菌株证实了MAB_3508c可以导致MAB从S向转变为R型。MAB_3508c被认为是结核分枝杆菌whiB7的同源基因，而WhiB7已被证明通过激活多药转运蛋白(tap，Rv1258c)[ 51 ]和核糖体甲基转移酶(erm，Rv1988)[ 52 ]的表达，在结核分枝杆菌内在抗生素耐药性中发挥重要作用；WhiB7还调节eis(Rv2416c)基因的表达，其已被证明可以减少宿主免疫反应[ 53 ]并增强巨噬细胞中分枝杆菌的存活[ 29 , 54 ]。虽然研究者未对MAB_3508c的功能进行验证，但该研究结果表明，它可以调控MAB的形态变化。
总之，关于MAB形态转换的分子机制，目前研究较为清楚、被公众所接受的是与GPL基因簇的基因突变有关，但是越来越多的研究表明，还存在其他基因参与MAB形态转换的调控( 表2 )，尽管这些研究并未详细描述各个基因在调控MAB形态转换中的具体功能。
总结与展望
有些菌株存在表型可塑性，可以随环境因素的变化如抗菌药物压力、温度及营养等发生形态转换，我们将这种形态转换称为可逆形态转换(Reversible morphological transformation，RMT)。有些菌株形态不受环境影响，形态变化只发生在基因偶发突变或通过基因改造之后[ 30 ]，这些菌株表型转变之后，不能再逆转为之前的表型，我们将这种表型转换称为不可逆遗传转换(Irreversible genetic transformation，IGT)。此外，不仅MAB的致病性及毒力等因素与其形态相关[ 55 ]，形态的改变还导致了耐药性的差异[ 56 , 57 , 58 ]，近期一项基于全基因组测序的研究结果显示MAB可能存在人际间传播[ 59 ]，使MAB的防治更具挑战。然而，不同MAB的形态变化可能具有较大差异，除GPL外，各种机制尚不明确，还须进行更大样本和更加深入的研究，这样有助于更好地了解疾病发病机制并为抗MAB治疗提供新的思路。
虽然目前MAB感染所致疾病的防治形势不容乐观，要彻底解决MAB感染所致疾病的诊治难题还道阻且长，但相信随着基因组学、转录组学、蛋白组学和代谢组学等生物组学和生物信息学越来越普及，同源重组、CRISPR等基因工程技术越来越成熟，对MAB的研究将越来越深入，将为更好地认识MAB的生物学特点，了解MAB与宿主的相互作用提供强有力的支持，在面临MAB的诊治困境中更有信心。
引用：李青,尚媛媛,任卫聪,等. "分枝杆菌世界的变形者"：谈谈脓肿分枝杆菌形态转换机制[J]. 中华临床感染病杂志,2023,16(03)：195-201.