非结核分枝杆菌病的噬菌体临床治疗策略
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非结核分枝杆菌(Nontuberculous mycobacteria，NTM)系指除结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的一大类分枝杆菌的总称。根据分枝杆菌的平板生长速度可分为快速生长型分枝杆菌(Rapid-growing mycobacterium, RGM)和缓慢生长型分枝杆菌(Slow-growing mycobacterium, SGM)[ 1 , 2 ]。NTM通常不致病，仅少数NTM在多个宿主因素影响下可感染人体引起NTM病，其中又以NTM肺病最为常见[ 1 ]。近年来，NTM感染的发病率呈快速上升趋势，多数呈慢性病程且治疗效果不确切，已成为亟需关注的重要公共卫生问题之一[ 3 ]。噬菌体是一类能够特异性感染细菌等微生物的病毒总称，具有宿主特异性并能良好裂解宿主菌，具有高度的多样性，并在治疗分枝杆菌感染，尤其是耐药结核感染与NTM感染应用方面具有广阔的应用前景[ 4 ]。本文通过对分枝杆菌噬菌体的基本生物学特性、治疗改造与应用以及临床存在的问题进行总结，以提高目前对NTM噬菌体研究及临床应用的认识。
1 分枝杆菌噬菌体的基本生物学特性
分枝杆菌噬菌体是一类特异性感染分枝杆菌的噬菌体，所有已发现的分枝杆菌噬菌体均为dsDNA长尾噬菌体或肌尾噬菌体[ 3 , 4 , 5 ]。分枝杆菌溶原噬菌体可通过酪氨酸整合酶或丝氨酸整合酶两种不同家族的整合酶完成噬菌体基因组的整合过程[ 6 , 7 , 8 ]，并主要通过以rep基因为核心的裂解周期调控系统调控噬菌体溶原与裂解周期。rep基因既能维持溶原噬菌体的溶原状态，也能阻挡同种、同簇噬菌体对溶原细菌形成超感染[ 9 , 10 , 11 , 12 ]。诱导噬菌体溶原周期与裂解周期，可分别观察到rep基因表达的上调与下调，人为敲除rep基因的溶原噬菌体不能维持溶原状态，转变为裂解噬菌体变种[ 11 , 12 ]。rep基因的DNA结合结构域和C端末尾结构域是噬菌体免疫特异性的决定因素[ 9 ]，其作用机制详见 图1 。基于rep基因调控溶原噬菌体溶原周期的机制，可将溶原噬菌体改造为可用于治疗的裂解噬菌体。
2 分枝杆菌噬菌体改造技术
噬菌体为生物研究中常用的一种基因递送载体，因此噬菌体基因工程技术的应用十分广泛。由于噬菌体具有宿主特异性，宿主谱显著窄于常用抗菌药物，且噬菌体常携带毒力因子或耐药基因，限制了噬菌体的临床广泛应用。因此，应用基因工程对天然噬菌体进行改造，增强已有噬菌体的侵染力与杀伤力，扩大噬菌体侵染范围成为一个重要的研究方向。
目前噬菌体治疗应用中，对噬菌体的改造主要集中在以下方面[ 13 , 14 , 15 ]：(1)通过基因敲除去除溶原噬菌体进入溶原周期的必需基因，如整合酶、rep基因等，将溶原噬菌体转变为裂解噬菌体；(2)通过基因重组替换从噬菌体识别到噬菌体裂解步骤过程中的关键基因，改变噬菌体的侵染特性或裂解特性，替换加入的基因可以为其他噬菌体的裂解系统或尾部识别位点等，乃至根据需要设计合成的基因序列或识别序列，后者过程也被称为基因重启动；(3)根据实际需要向噬菌体加入不同功能的基因，直接加强噬菌体抗菌能力或辅助其他治疗方式增强抗菌治疗效果。
目前，电穿孔DNA噬菌体重组技术(Bacteriophage recombineering of electroporated DNA, BRED)是最常用的溶原噬菌体改造技术[ 16 , 17 , 18 ]，也是目前应用于分枝杆菌噬菌体改造的最成熟的技术之一。Dedrick等[ 17 ]应用BRED技术敲除溶原噬菌体的rep基因，并应用于后续临床治疗中取得了可观的治疗效果，首次证实：经基因工程编辑的噬菌体、敲除rep基因构建的溶原噬菌体裂解变种应用临床是安全、有效的。随后，该团队在后续研究[ 16 , 18 ]中描述了2株应用电穿孔DNA噬菌体重组技术改造的噬菌体，分别敲除了酪氨酸整合酶以及下游基因，以及同时敲除rep基因以及酪氨酸整合酶，同样在临床应用中得到了良好的治疗效果。从上述研究中可看出，溶原周期关键基因作为溶原噬菌体整合特性的核心，直接敲除部分或全部基因组件是一种相对简易、泛用的噬菌体改造方式，可将原本不宜用于治疗，但却具有良好裂解特性的溶原噬菌体纳入可用范围，其疗效和安全性都能得到有效保证。BRED技术原理[ 19 ]基于分枝杆菌噬菌体Che9c所表达的RecE/RecT样蛋白系统研发，在此基础上加以电穿孔刺激，可诱导噬菌体DNA与外源导入的同源DNA模板在耻垢分枝杆菌细胞质内进行同源识别重组。基于此系统原理，如需敲除目标基因，可构建目标基因上下游的同源序列直接连接的DNA模板；如需在目标序列内引入突变位点，可构建具有特定位点突变的同源DNA模板；如导入外源噬菌体的相似基因序列，可构建不同噬菌体的同源基因模板。目前，应用BRED技术改造并应用于临床治疗的分枝杆菌噬菌体见 表1 ，均为利用该技术对噬菌体溶原周期关键基因进行敲除，如敲除维持溶原期的rep基因或敲除整合过程必须的int基因等。尚未有利用BRED技术对分枝杆菌噬菌体引入基因或引入同源重组基因的报道。
另一种常用于噬菌体基因工程的基因编辑技术为CRISPR/Cas9技术[ 14 , 22 ]，该技术源自细菌拥有的成簇规律间隔短回文重复序列免疫系统，能特异性识别DNA序列并精准切断DNA，进而被开发为高效的DNA编辑技术。CRISPR/Cas9应用于噬菌体改造主要在两方面：(1)对噬菌体尾部蛋白进行编辑，变更噬菌体识别位点，变更或扩大噬菌体宿主范围；(2)或使噬菌体在胞体内表达能够直接、间接杀灭细菌的蛋白，如解聚酶、水解酶等分解生物膜、细胞壁等，增强噬菌体杀伤力。该基因工程改造思路在其他噬菌体上已有体现，但尚未广泛应用于分枝杆菌噬菌体。
总体而言，尽管噬菌体基因工程已较为成熟，分枝杆菌噬菌体治疗也已取得初步结果，分枝杆菌噬菌体基因工程应用于治疗方面仍处于起步阶段，目前仅有针对噬菌体溶原周期关键基因编辑的噬菌体，暂无裂解系统、识别系统重组噬菌体以及其他类型噬菌体应用于NTM病治疗。
3 分枝杆菌噬菌体临床治疗NTM病应用
NTM病的治疗始终是临床上的难题之一[ 23 ]。因此，应用噬菌体治疗NTM病得到广泛关注。2019年，Dedrick等[ 17 ]报道首例利用基因工程编辑噬菌体治疗NTM感染的案例。该例患者为肺囊性纤维化，双肺移植后免疫抑制发生脓肿分枝杆菌播散感染不能控制。研究筛选1株裂解噬菌体Muddy和2株溶原噬菌体ZoeJ、BPs，敲除ZoeJ携带的rep基因，并筛选BPs的感染免疫逃逸突变体、宿主突变体加强其侵染能力，最终使用1株裂解噬菌体和2株改造后的溶原噬菌体制成鸡尾酒制剂，制定每剂109 PFU含量，每12小时静脉注射以及单次伤口局部皮肤注射的治疗方案，接受32周治疗后，患者肺功能、手术伤口愈合状况得到了明显改善，除皮肤结节外，血液、痰液未再分离到致病菌，且对噬菌体的耐受良好，无明显不良反应，未产生高滴度的噬菌体中和抗体。这项研究开创多个先例，为首次应用噬菌体治疗NTM病患者，首次应用基因工程噬菌体治疗临床患者，首次证明分枝杆菌噬菌体治疗、基因工程噬菌体治疗的有效性与安全性。随后，2021年该研究团队用同一组分枝杆菌噬菌体鸡尾酒治疗了1例81岁支气管扩张合并难治性脓肿分枝杆菌感染的患者，该患者无免疫抑制基础，治疗耐受性良好，且在启动治疗后2个月内观察到了痰菌量的明显下降，但治疗第6个月痰菌量再次回升，在患者的血清中检测到了对3种噬菌体的高滴度中和性抗体[ 24 ]。2022年该团队总结了20例耐药NTM感染患者的噬菌体治疗研究结果[ 18 ]，绝大多数为肺囊性纤维化伴脓肿分枝杆菌感染。研究中所有患者治疗耐受良好，无明显不良反应。
目前，国内尚无明确的噬菌体治疗NTM病患者的研究报道。国外的研究报道结果均展示了分枝杆菌噬菌体的潜在抗NTM感染能力与良好的安全性、耐受性，所有患者均未出现明显不良反应，并且在一部分患者中能够取得相当不错的治疗效果。同时，经基因工程编辑敲除溶原整合关键基因后，获得的衍生噬菌体与天然噬菌体的安全性相当，表明基于此原理敲除技术的可用性，使得一大部分的溶原噬菌体也能够成为潜在的治疗选择，扩大了噬菌体的可用范围，使NTM噬菌体治疗的可及性增加。
4 分枝杆菌噬菌体治疗NTM病存在的问题
噬菌体(包括基因工程改造噬菌体)治疗NTM感染是一种安全且有效的治疗方式，在抗菌药物治疗无效，患者病情持续进展期间能有效控制NTM感染，改善患者生活质量。但目前，多种因素仍限制分枝杆菌噬菌体的临床应用，主要有以下几个方面：(1)尽管目前研究均支持噬菌体是一种安全有效的治疗方式，但对于免疫正常宿主而言，噬菌体仍是一种外来病毒，在治疗过程中容易激发并产生噬菌体抗体，高滴度的噬菌体抗体可能导致即刻或长期治疗效果无效。对此，可考虑序贯或间断应用的给药方案，避免同时产生多种噬菌体中和抗体导致全部可用噬菌体失效的情况；(2)噬菌体宿主范围窄，能够用于临床治疗的NTM噬菌体选择有限，部分NTM无法找到对应有效的噬菌体加以裂解，如Dedrick等[ 16 ]在2021年的研究中发现，细胞壁缺乏糖肽脂，表现为光滑型菌落的脓肿分枝杆菌无法在现有建立的噬菌体库中找到有效裂解的噬菌体；(3)噬菌体筛选、制备过程复杂，不同患者需要制订个性化的噬菌体治疗方案，治疗周期长。可考虑利用基因工程技术修改噬菌体尾部基因，变更识别位点，增强噬菌体吸附与裂解能力，探寻相对广谱噬菌体的构建方法；也可变更噬菌体搜寻思路，从致病分枝杆菌内分离，寻找裂解能力更强，宿主范围更广的噬菌体；(4)噬菌体治疗脓肿分枝杆菌感染效果总体不够确切，部分患者短期内获益有限，多数患者不能取得微生物学转阴结果，对于这部分噬菌体治疗无应答或低应答的患者，其原因有待进一步研究。
5 总结与展望
分枝杆菌噬菌体与一般噬菌体相比有相似之处，也有其独特之处。分枝杆菌噬菌体独特的裂解系统是其适应分枝杆菌细胞壁结构的结果。分枝杆菌基因组中广泛存在噬菌体基因序列，其超感染免疫系统既是分枝杆菌抵御超感染所必需，也是噬菌体溶原状态维持所必需，两者相互影响。分枝杆菌的耐药基因、毒力基因相关研究有限，与噬菌体相关研究较少。噬菌体治疗对于NTM感染有可预见的价值，可用于对抗菌药物治疗无效或不能耐受治疗的患者，但其临床应用仍然受限于分枝杆菌噬菌体的可用总量与适用范围，对部分表型分枝杆菌感染无能为力，且治疗效果尚不尽如人意，克服宿主免疫与相关给药方式仍需探索。分枝杆菌噬菌体的基因工程编辑研究尚在进行中，已有的研究结果表明基因工程编辑噬菌体应用于临床是安全有效的。未来，分枝杆菌噬菌体相关机制与临床应用仍需深入研究，探索多源化的基因编辑方式，以提高、巩固噬菌体对患者的总体治疗效果。
引用：栾似春,李娜,胡必杰. 非结核分枝杆菌病的噬菌体临床治疗策略[J]. 中华临床感染病杂志,2023,16(03)：190-194.