mRNA疫苗关键质量属性

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在过去的30年里，体外转录(in vitro transcription，IVT)已经成为设计和制备mRNA的通用技术，几乎能够编码任何蛋白质。mRNA治疗方法的成功实施将预防或治疗任何以一种或几种关键蛋白缺失为特征的疾病，包括癌症、遗传疾病和传染病。自2019年以来，由于SARS-CoV-2的出现，该领域的焦点已转向使用mRNA疫苗预防传染病。

mRNA疫苗也存在制约其有效性的关键质量属性，本文稍作梳理。

颗粒大小

mRNA疫苗颗粒大小是影响递送效率的最主要的参数，影响生物分布、免疫同源性、内化、降解、清除和细胞摄取。

由于扩散和对流减少，200纳米的亚单位疫苗难以进入间质的流体流动。注射到间质的mRNA疫苗 (例如通过肌肉、皮下或皮内注射)，通常需要颗粒小于200nm，因为这种大小的纳米颗粒倾向于被运输到淋巴系统，相比之下，更大的颗粒被保留在注射部位。总的来说，对大小的要求取决于给药途径、实验条件和靶器官。Irvine, Aung, and Silva最近报道，抗原递送到树突状细胞与疫苗的大小密切相关，无论颗粒的组成如何，小于50nm的颗粒显示出更高的递送效率。

不同给药方式与淋巴系统递送（Nat. Rev. Drug Discov. 14 (2015) 781–803）

大小偏好也可能因细胞的不同而不同。例如，在转染人胚胎肾293细胞和人脂肪细胞时，携带50nm mRNA的颗粒优于100nm的颗粒，但在人肝细胞中没有显著差异。

此外，给药途径可能会根据给药装置施加额外的尺寸限制，例如，1-5μm微粒或由于肺沉积的空气动力学，含有纳米颗粒的微滴可能更适合输送到肺。用于肺输送的mRNA雾化导致多聚体，增加大小和多分散性；脂质纳米颗粒暴露于生物介质中会导致生物大分子冠的形成，大小增加20%；脂质纳米颗粒的冻干以长期储存可能导致粒径增加高达4倍，这取决于储存条件。

此外转染对于大小的影响，不能独立于其他因素。纳米颗粒表面蛋白质冠的形成可以决定摄取途径，冻干不仅会改变颗粒聚集的发生率，而且还会改变脂质成分的重组。总的来说，需要更多的关于大小依赖性mRNA递送的研究来充分揭示其影响程度。

表面电荷

电荷在mRNA疫苗的生物分布和有效性中起着关键作用。带负电荷的碳水化合物屏障（如细胞间质、粘液和质膜表面的糖萼和粘蛋白）影响纳米载体在体内环境中的运输，这些屏障带有阴离子凝胶样基质（由糖脂、蛋白聚糖、低聚糖和糖蛋白组成），因此，带正电荷的载体的运输可能会受到阻碍。例如，尽管阳离子纳米粒子与APCs有亲和力，但由于间质的对流限制，它们很难到达淋巴结。相比之下，阴离子纳米颗粒可在间质中扩散，并在淋巴结中显示出更好的保留性；但由于细胞膜的负电荷，不能轻易进入细胞内空间。而阳离子脂质体等带正电荷的材料可以完全包裹阴离子mRNA。因此，这种mRNA纳米载体具有正表面电荷与带负电荷的细胞表面结合，如细胞和内体膜，进而释放内容物。虽然阳离子递送载体在转染方面取得了各种成功，但是因为脱靶效应等显示出细胞毒性（文献2）。如上所述，传递载体上的正电荷对包装好的mRNA的细胞摄取和细胞内小体逃逸至关重要；然而，这种电荷不应该持续存在。

令人不安的是，在传递遗传有效负载的纳米颗粒的核心中加入带电的部分可能会导致器官特异性的摄取。程等人报道称，当静脉注射带正电荷的脂质给予小鼠时，带正电荷的脂质导致优先靶向小鼠肺，而带负电荷的脂质靶向脾脏。在没有这些带电脂质的情况下，LNPs优先靶向肝脏（文献3）。值得注意的是，通过zeta电位测量确定，LNPs没有实质性的表面电荷，表明电荷完全包含在内部。这一重要的发现强调了电荷在细胞摄取途径中的作用。

不同电荷LNP的器官选择性（文献3）

形状结构

形状和内部结构都是影响其与生物环境相互作用，是影响细胞摄取的重要结构参数。形状和内部结构都可能影响递送载体表面的刚性，改变与细胞和细胞内小体膜相互作用的性质。虽然形状特异性材料的制造在纳米技术中很常见，但由于技术挑战，基因传递载体设计尚未得到充分开发，许多常见的x射线和电子技术对精细的样品具有破坏性，可能会歪曲内部结构。

低温透射电子显微镜（cryo-TEM）和小角度x射线散射(SAXS)更容易捕获“软”纳米粒子结构特征。用低温透射电镜对mRNA传递载体的表征比SAXS更常见。部分原因是cryo-TEM纳米材料结构的分析可以以定量和定性的方式进行，而SAXS提供了聚集体的信息。

LNPs的cryo-TEM显微图

表面成分

mRNA载体的递送效率和生物分布受到载体表面成分的影响。纳米颗粒的PEG化改变了纳米载体的运输，通过防止与血清蛋白和吞噬细胞的相互作用，来延长体内递送载体的半衰期，并通过增加亲水性来增强递送载体的溶解度和稳定性。虽然PEG在纳米载体的生物分布和半衰期中起着关键作用，但由于空间位阻，它阻碍了细胞对纳米颗粒的有效吸收，并抑制了与质膜的相互作用。因此PEG链被设计为在血清中分离，以减轻空间位阻，并允许纳米载体与ApoE相互作用，从而通过ApoE介导的内吞作用进入细胞。

在纳米载体上加入碳水化合物（如甘露糖）也会影响向淋巴结的运输和对免疫细胞的摄取。例如HIV纳米颗粒免疫原的三甘露糖基化导致强烈的生发中心反应。利用聚糖的先天免疫识别也可用于mRNA疫苗免疫。据报道，与纯LNP相比，封装H3N2流感病毒血凝素编码mRNA的甘露糖基化LNPs，在血凝素试验中表现出更强的抑制作用。

小编总结

国外mRNA疫苗的接连获批，必然会掀起mRNA疫苗的研发热潮。本文梳理了mRNA疫苗的四个关键质量属性：颗粒大小、表面电荷、形态结构、表面成分，供感兴趣的读者阅读参考。

参考文献

1.N.L. Trevaskis, L.M. Kaminskas, C.J.H. Porter, From sewer to saviour — targeting the lymphatic system to promote drug exposure and activity, Nat. Rev. Drug Discov. 14 (2015) 781–803

2.H. Lv, S. Zhang, B. Wang, S. Cui, J. Yan, Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery, J. Controlled Release. 114 (2006) 100–1

3.Qiang Cheng et al，Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR–Cas gene editing，Nature Nanotechnology volume 15, pages313–320 (2020)

4.J.A. Kulkarni, D. Witzigmann, J. Leung, R. van der Meel, J. Zaifman, M.M. Darjuan, H.M. Grisch-Chan, B. Thöny, Y.Y.C. Tam, P.R. Cullis, Fusion-dependent formation of lipid nanoparticles containing macromolecular payloads, Nanoscale 11 (2019) 9023–9031

5.X. Zhuang, Y. Qi, M. Wang, N. Yu, F. Nan, H. Zhang, M. Tian, C. Li, H. Lu, N. Jin, mRNA vaccines encoding the HA protein of influenza A H1N1 virus delivered by cationic lipid nanoparticles induce protective immune responses in mice, Vaccines 8 (2020) 123

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