第二章 第三节 生物样品的提取与纯化
生物样品的提取与纯化
n 生物物质纯度越高，越容易深入透彻研究；
n 传统提取多为溶剂萃取，效果不佳
n 新型的生物样品提取技术包括：超临界流体萃取、微波萃取、固相萃取等；
3.1超临界流体萃取技术（SFE）
n 超临界流体萃取技术是近年来广泛研究和使用的一种新型萃取方法，具有独特、高效、清洁等优点；
n 广泛用于食品工业、中药分析、精细化工、生物技术、医药保健、环境等领域；
3.1.1.1超临界流体特性
n 超临界流体：当物质所处的温度高于临界温度，压力大于临界压力时，该物质处于超临界状态；指处于液体与气体之间的临界状态的单一相态，
n 兼有液体和气体的优点：
a，密度接近液体，具有强溶解能力；
b，黏度接近于气体，扩散系数远大于液体，容易扩散传质；
c，具有零表面张力，容易进入被萃取物的微孔内，与提取物质充分接触；
3.1.1.2SFE的萃取原理
n 通过控制超临界流体的温度和压强，改变其对不同极性、沸点以及分子量大小的溶质的萃取能力。
n 萃取后，固液分离或溶剂分离，之后将流体变为气体，使之与提取物彻底或基本分离；
3.1.1.3超临界流体萃取中常见溶剂
n 常见超临界流体见下表。
n 其中以CO2最为常用，因为其具有以下特点：a：临界压力温度容易实现；b：多种溶质易溶于其中，但水不易溶解其中；c：不燃、不爆、不腐蚀、无毒害、化学稳定、廉价易得，易于分离；
3.1.2SFE的特点
n SFE可以在接近室温下提取，特别适用于热敏物质；
n SFE是最干净的提取方法；
n 萃取与分离二合一；
n 流体可以在提取过程中循环使用；
n 压力与温度是调节萃取过程的主要参数，易于控制；
3.1.3SFE的萃取流程：
n 经粉碎、除杂或轧片后的物料进入萃取容器；
n 加入超临界流体
n 可溶性成分进入流体；
n 流体与固相（或水相）分离；
n 调节压力，释放萃取物；
n 流体回收；
3.1.4 SFE过程的影响因素
n 物料的预处理：含水量、颗粒度；
n 萃取压力
n 萃取温度；
n CO2流量；
n 萃取时间；
n 夹带剂。
• 1 咖啡中咖啡因的脱除：超临界流体萃取技术最早应用于食品领域是从咖啡中脱除咖啡因。由于健康理念的改变,西方国家对脱咖啡因的咖啡需求增加了,1979 年,西德的HAG公司率先采用CO2 萃取,然后用活性炭吸附以分离咖啡因。与此相类似的还有从烟草中脱除尼古丁,从红茶中脱除咖啡因,从绿茶中脱茶多酚等。
• 2 生理活性物质的提取：超临界CO2能选择性地溶解卵黄中的中性脂质和胆固醇,却不能溶解磷脂和蛋白质,因此可用于蛋黄中卵黄油的分离,分离得到的卵黄油品质较好,且卵黄蛋白的功能性质也不受影响。儿茶素也是一种功能性成分,用超临界技术萃取儿茶素,提取率较高,所得的物质纯度也较高。二十碳五烯酸(EPA) 对于防止心脏病、动脉硬化及糖尿病有积极疗效。传统方法是用混合溶剂萃取,产品脂肪酸组成较复杂,如用超临界萃取,产品纯度较高。
n 一种传统提取方法的改进；
n 广泛用于医药、食品以及化工等行业；
n 微波是指波长在1mm~1m（300~300,000MHz）的电磁波；
n 常用波长为2450MHz；(工业为950MHz)
n 微波作用于样品时，样品内极性分子的磁场方向会随微波磁场方向的变换而转动，引起分子键的振动、撕裂以及粒子间的摩擦，进而产生大量的热能，引起温度升高；
n 不同物质的介电常数不同，对微波的响应有所区别，产生热量也不同；另外也导致萃取物与载体间受热不同，促进二者的分离；
n 微波加热使内外同时加热，加热效率高，无热惯性；
优点：
n 实际用量少，节能、污染小；
n 加热均匀，且热效率较高；
n 无热惯性，过程易控制；
n 微波萃取无需干燥等预处理，简化工艺；
n 批量大、效率高，省时；
n 微波萃取选择性好；
n 微波萃取不受物料含水量影响；
缺点：
n 仅适用于热稳定性物质；
n 萃取材料具有良好的吸水性；
n 微波萃取的选择性会受到影响；
n 有一定危险性；
n 微波萃取设备常见两种，一种是微波萃取罐，为分批次设备；另一种连续微波萃取线；
n 微波设备中常用的关键材料为聚四氟乙烯；
n 微波萃取必须使用极性溶剂，或者非极性溶剂中添加适量极性溶剂；
n 微波萃取的基本流程为：
选料—清洗—粉碎—微波萃取—分离 —浓缩—干燥—粉化—产品；
n 萃取的温度
n 萃取溶剂的影响
n 萃取功率及时间的影响；
n 样品基体的影响；
n 样品杯材料吸附及记忆效应的影响；
固相萃取
n 利用固体的选择性吸附性能将目标成分吸附，再利用洗脱液或加热来解吸附；
n 一种基于液-固色谱理论的过程，与液相色谱同理；
n 选择性吸附、选择性洗脱；
n 简单的色谱过程；
n 也可以同时吸附目标物质和干扰物质，然后选择性洗脱目标物质；
n 分析物的高回收率；
n 更有效的分离分析物与干扰组分
n 不需要超纯溶剂，对有机溶剂消耗较少；
n 能处理小体积样品；
n 无相分离操作，容易收集分析物组分；
n 操作简单、省时、省力、易于自动化；
n 水中有机污染物的痕量富集；
n 大气样品的预处理，兼有萃取与富集作用；
n 食品分析（农药残留），刑事鉴定（毒品），临床分析（药物含量）等；
根据相似相溶原理：
n 正相SPE：吸附剂与目标物均含有极性基团，如血浆中萃取维生素；油脂分离；花生酱中分离黄曲霉素；；
n 反相SPE：吸附剂和目标物均为非极性或弱极性的，如从血浆或尿液中萃取药物；水中萃取农药；血浆萃取多肽；
n 离子交换：静电吸附作用，包括阳离子交换和阴离子交换，如血浆中萃取茶酚胺；尿液中萃取碱性药物；土壤中萃取除草剂；细胞液中萃取核糖核酸酶；
n 选择SPE小柱或滤膜；
n 活化：常用甲醇，水以及缓冲溶液；
n 上样前预处理：a，调节酸碱度；b：甲醇或乙腈；c：超声处理；d：离心，去上清液；e：稀释；
n 上样：以一定流速通过小柱或滤膜；
n 洗涤：水，缓冲液，适量有机溶剂；
n 洗脱：根据目标物的极性，采用合适洗脱液；
n 后续处理：冷冻干燥，高效液相色谱柱进一步分析；
n 吸附剂；
n 洗脱剂；
n 保留体积：萃取时所需要的最小样品体积；
n 流速：mL/min