双特异性抗体药物在抗肿瘤治疗中的应用丨医麦精品汇
2018年3月9日/医麦客 eMedClub/--目前已经有超过39 种单克隆抗体药物被相关机构认证并且运用到了临床抗肿瘤治疗中，虽然它们给肿瘤免疫治疗带来了突破性的成效，但是其疗效往往有限，如其中一些会产生耐药性，从而导致部分患者用药后不响应，或是在初始响应后出现复发再进展。普通的肿瘤治疗性抗体只能结合单一的抗原，其结合特异性相对较低，容易发生脱靶效应。双特异性抗体( Bispecific antibodies，bsAbs) 能分别识别和结合两种不同的抗原，所以它可以把免疫细胞、病毒分子等连接到肿瘤细胞上，进而增强对靶细胞的杀伤作用，同时它也可以结合同一肿瘤细胞上的不同抗原以增强其结合特异性，从而减少脱靶毒性等副作用。这种具有双功能的重组抗体作为治疗肿瘤的药物拥有比单抗药物更高的疗效。1986 年，Staerz 和Bevan 第一次利用双特异性抗体把细胞毒性T 淋巴细胞( CTL) 运用于癌细胞溶解实验。2014 年12 月，美国食品和药品监督管理局( FDA) 批准安进公司研发的双特异性抗体免疫治疗药物Blinatumomab 用于复发性或难治性的费城染色体阴性( Ph-) 前B 细胞急性淋巴细胞白血病( Acute lymphoblastic leukemia，ALL) 的治疗，其临床Ⅱ期数据显示在189 个接受Blinatumomab 单药治疗的患者中有81 个病人( 42. 9%) 在经过两次药物注射后达到完全缓解。
1、双特异性抗体的分类
抗体是含有重链和轻链的蛋白分子，可分为恒定区( C 区) 和可变区( V 区) ，由此可以依据是否含有恒定区对双特异性抗体进行分类，此外还有一些含有非抗体片段的双特异性抗体。
1. 1 不含C 区的双特异性抗体
这类BsAbs 仅含有抗体分子的可变区段，因此其结构与一般抗体差别很大，也可以称之为非IgG 样结构的双特异性抗体。它只保留了结合抗原的片段，所以相对分子质量通常很小，故具有较高的组织渗透率，很容易透过血管进入到肿瘤组织中。但是低分子质量也导致了它在血浆中的半衰期较短，所以采用这种药物进行抗肿瘤治疗需要给予持续性的恒流泵静脉滴注或是以缓释剂型的方式给药。
抗体的重链可变区( VH) 和轻链可变区( VL) 通过15 ～ 20 个氨基酸组成的柔性肽连接形成单链抗体片段( Single chain variable fragment， scFv) ，两个不同的scFv 片段可通过一个短肽串联形成一种不含C 区的双特异性抗体，并通过它把T 细胞和肿瘤细胞连接起来，故可以称之为双特异性T 细胞衔接器( Bispecific T cell Engagers，BiTEs)。VLA-VHA 和VLB-VHB 组成的两种单链抗体片段分别在空间上形成两种不同的构象，再分别与两种不同的抗原结合。在体外细胞培养实验中，一个低浓度( 10 pg /mL) 的BiTEs就可以引发强大的肿瘤消除作用并最终导致特异的肿瘤细胞溶解。研究证明串联的scFv 片段具有募集效应淋巴细胞的能力，如抗CD3 和抗CD19 的BiTEs 在几种不同的B细胞淋巴瘤的临床治疗中都产生了很好的疗效。目前已有3 种BiTEs 药物在临床前研究中应用于实体瘤治疗，它们分别定位不同的肿瘤抗原( EpCAM、CEA 和PSMA) 并取得了一定成效。Blinatumomab( AMG103 /MT103) 是临床发展中最前沿的BiTEs 药物，它能结合急性淋巴细胞白血病( ALL) 细胞表面的CD19 抗原，同时也在临床前研究模型中发挥了强大的肿瘤消除作用，其有效剂量可以低至0. 005 ～ 0. 06 mg /㎡。
双价抗体( Diabody) 也是一种不含抗体C 区的BsAbs，它是把两个不同抗体可变区的轻链和重链交叉配对，其间通过一个短肽相连故使其无法在空间上配对，再通过一个较长的肽链把两种不同配对中同一抗体可变区的轻重链连接起来，最后Diabody 会在中间发生回折使同一抗体的轻重链在空间上配对形成二聚体结构。有文献报道这种BsAbs两端的抗体亲和力会发生变化，以二聚体形式结合的可变区轻重链的亲和力可以提高近10 倍，并能在抗肿瘤免疫中起作用诱导产生大量的细胞因子来消灭肿瘤细胞，如IL-2、IL-7、IL-10、IL-15、IL-18、TNF-α 等。两个Diabody连接起来可以形成一个名为串联双抗体( TandAb) 的四价二聚体派生物，它针对不同抗原都有两个相同的结合位点，其相对分子质量相对较高，结合效率也更高。另外，还有一种新型的BsAbs 与Diabody 的结构非常相似，但是它还含有一个链内的二硫键对其起到一个稳定的作用，称之为双亲和重定向分子( Dual-affinity Ｒetargeting moleculars，DAＲTs) 。
1. 2 含有C 区的双特异性抗体
这种含有恒定区的BsAbs 的结构与一般的抗体结构非常类似，又称为IgG 样结构的双特异性抗体。它与一般IgG 抗体和非IgG 样结构的bsAbs 不同，因为它既具有双特异性又保留了恒定区的相应功能，另外其分子量相对较大，故具有较高稳定性和较长半衰期，也更有利于抗体产物的纯化，但其组织渗透率也相对较低。根据其融合的不同结构域，可形成不同的类型，如scFv-Fc antibody、Minibody、Bi-nanobody 等。
ScFv-Fc antibody( 100 ～ 105 k) 是一类同时含有scFv 和Fc 段的BsAbs， scFv 段可以与人IgG的CH2和CH3融合，还可以与铰链区融合。研究证明它在肿瘤治疗中具有一定疗效，而且这种抗体也具有一定的小分子特性，故便于利用基因转移技术维持其体内含量。Johnson 等在实验中将一个编码抗猴免疫缺陷病毒的scFv-Fc antibody( 4L6) 的腺病毒载体通过肌肉注射输入体内，可以监测到长期而持续的抗体表达。
Minibody( 80 k) 也是一种含有C 区的BsAbs，它是通过把抗体分子的scFv 段融合到人IgG 的CH3结构域的C端。临床研究中利用这种结构的抗体来治疗癌症患者后，再通过正电子发射成像( PET) 或计算机断层成像( CT)来监测患者的肿瘤发展状态，证实其确实具有功效。Han等发现通过静脉注射编码抗趋化因子4( CCＲ4) Minibody的腺病毒载体可以引起机体的抗肿瘤反应。此外，据报道Minibody 在使用基因治疗的皮肤T 细胞淋巴瘤模型中也具有一定疗效。
1993 年，Casterman 报道了一种存在于骆驼或美洲驼体内的特殊抗体，它是目前发现的最小的抗体，不含轻链，仅由一个重链可变区和CH2、CH3区组成，称为纳米抗体( Nanobody)，这种抗体相对分子质量很小，构象稳定，而且具有较高的耐受性。两个具有不同特异性的纳米抗体通过一个肽链相连即可形成一个双特异性纳米抗体( Bi-nanobody)。目前相关的药物有正处于Ⅰ期临床研究的抗IL17A 和IL17F 的药物ALX-0761，还有处于临床Ⅱ期研究阶段的Ozoralizumab。
1. 3 含有非抗体片段的双特异性抗体
有些双特异性抗体所含有的一些特殊的非抗体结构也具有一定作用，如有些BsAbs 分子质量小，所以具有较快的血浆清除率，在肿瘤组织中停留的时间也较短，最后导致其疗效降低。有研究者通过化学连接的方法在BsAbs中连接一些分子以增加其相对分子质量，延长其半衰期，进而增进其疗效，如连接聚乙二醇( PEG) 、血清白蛋白和白蛋白结合基团等。PEG 是一种聚合物，可以增大BsAbs 的相对分子质量从而减少其肾滤过率，但是有些时候它可能会导致抗体片段的部分失活或是亲和力降低，所以要根据不同的抗体分子结构结合不同的非抗体片段。此外还可以通过连接一些药物分子来增强其疗效，常用的有白喉毒素、蓖麻毒素、相思豆毒素等。
2 肿瘤治疗机制
2. 1 募集和激活免疫细胞
双特异性抗体可以结合两个靶向位点，一个是肿瘤细胞表面的肿瘤抗原，另一个是免疫细胞表面的抗原，如T 细胞、NK 细胞等，其中最主要的是T 细胞的募集。T 细胞具有强大的抗肿瘤作用，广泛存在于全身血液循环中，当机体某一部位发生癌变后，它很难集中于该部位来发挥作用，一是肿瘤细胞会抑制T 细胞激活，二是由于T 细胞表面的Fc 受体很少，很难通过一般的抗体来连接肿瘤细胞。BsAbs 能同时结合T 细胞表面的抗原和肿瘤抗原，使肿瘤细胞和T 细胞紧密连接起来，所以它能让T 细胞迅速募集于肿瘤组织处并对其进行有效消除。此外，它还能通过靶向CD16 募集NK 细胞，或是通过激活单核细胞、巨噬细胞和树突细胞等免疫细胞来杀伤肿瘤组织。
2. 2 封闭肿瘤信号通路
抗原缺失或调变、共刺激信号异常、免疫抑制分子表达等都可以使肿瘤细胞逃避免疫系统的杀伤。如当某些组织癌变以后会刺激T 细胞高表达PD-1，但肿瘤细胞同时也会过量表达PD-L1 或PD-L2 来抑制T 细胞的激活，导致T细胞无法发挥抗肿瘤作用。BsAbs 可以避免肿瘤细胞表面的PD-L1、PD-L2 与其受体PD-1 结合，从而阻断肿瘤细胞抑制T 细胞激活的信号通路。BsAbs 靶向定位的肿瘤抗原也可以封闭肿瘤中某些异常激活的信号通路，从而抑制癌基因的表达与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。另外，BsAbs 还可以结合同一肿瘤细胞的两种不同抗原以提高抗体与其亲和力，并通过同时封闭两个信号通路来提高抗肿瘤治疗疗效。
2. 3 结合Fc 受体
抗体恒定区由轻链恒定区( CL) 和重链恒定区( CH) 组成， IgG 的CH 区含有CH1、CH2和CH3 3 个结构域，CH2和CH3组成了IgG 的Fc 段。有些含有C 区的BsAbs 上连接有Fc 段，故可以结合具有杀伤活性的细胞( B 细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等) 上的Fc 受体，进而发挥其对肿瘤细胞的杀伤作用。如抗体依赖的细胞毒作用( ADCC) 、抗体依赖的细胞吞噬作用( ADCP) 、补体依赖的细胞毒作用( CDC) ，另外还有Fc 段的调理作用和介导Ⅰ型超敏反应。
2. 4 连接药物分子
有些双特异性抗体上含有一些药物分子位点，这些抗体不仅能介导机体免疫系统起作用，还能通过结合和携带药物分子起作用。这些分子可以为放化疗药物、酶、细胞因子或其它生物毒素，统称为免疫毒素，它可以通过和抗体结合来进行导向治疗。如可以将药物分子直接连接在BsAbs上进行治疗，或是将BsAbs 连接到癌细胞以后，再将含有免疫毒素的肽注射到体内，这些药物可以特异性结合到肿瘤部位发挥作用，进而减少在正常组织细胞处停留的时间以降低其副作用。
3 目前进展及研究现状
随着全球环境的恶化和人们生活习惯的改变，肿瘤的发病率越来越高，肿瘤患者的死亡率也逐渐上升，故抗肿瘤药物的市场将不断扩大。双特异性抗体是抗体药物领域中的一个新概念，被视为肿瘤治疗的第二代抗体，拥有广阔前景。2014 年6 月由Marketwatch 发布的一份报告显示，2023 年双特异性抗体药物的市场将达到44 亿美元。近10 年来，应用双特异性抗体来进行肿瘤治疗的研究已经取得了一定进展，多家生物医药公司也开展了多种相关药物的研发，Trion Pharma 公司的Catumaxomab 和Amgen 公司的Blinatumomab 在临床试验中表现优秀并成功上市，有利的证明了双特异性抗体药物的有效性。迄今为止，尚还有超过100 个双特异性抗体药物正处于研究阶段，其中大多数都处于临床前和临床Ⅰ期阶段，说明了该药物还有值得改进和创新的地方，见图1。
低成本、低剂量和利于工业化放大等优势拓展了双特异性抗体药物的市场空间，科学技术的提高进一步带动了它的研究和发展，但是仍然存在一些亟待解决的问题。如早在1996 年基因泰克公司就发明了能够让不同抗体重链正确组装的Knob-in-hole( KiH) 杂交二聚技术［29］，但是因为没有解决轻链配对问题导致其产量较低、产品纯化复杂，虽然后来罗氏集团在KiH 技术上进一步发展了Crossmab 等技术，解决了轻链联结的问题，使其正确配对率大大提高，但是仍然会有副产物的产生，而且需要多种技术联用才能取得较好的效果。
随着科学研究技术的发展，可以通过改变双特异性抗体的结构、相对分子质量和化合价来改善其血浆清除率、组织渗透率和药物代谢动力学等，进而提高其成药稳定性和临床疗效。目前国内对于双特异性抗体的相关研究正处于萌芽阶段，但是凭借其在抗肿瘤治疗中的巨大潜力，相信我国在该领域将拥有巨大的发展空间，投入的提高和技术的成熟将推动该行业进入黄金时期。未来可以利用更多更好的策略来优化各种双特异性抗体药物，使其具有更强大的疗效和更低的副作用，为肿瘤患者带去福音。(作者简介: 袁庆云，女，硕士研究生在读，研究方向: 基于蛋白质构效关系研制新型生物技术新药; 于敏，男，教授，博士生导师，研究方向: 基于蛋白质构效关系研制新型生物技术新药）