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2021年6月8日/医麦客新闻 eMedClub News/--CAR-T技术已在血液瘤治疗上取得了很好的成绩，但是将其应用于实体瘤仍面临着体内扩增不足、肿瘤微环境、制备周期长、成本高等难题。随着肿瘤免疫细胞治疗研究的深入, NK细胞、巨噬细胞、TIL等新型细胞的应用也越来越受到关注。近年来，这些创新的技术进步飞速，iPSC来源的CAR-NK, CAR-M也已经先后问世，为整个肿瘤免疫领域的发展带来更多突破可能。
NK（天然杀伤）细胞是一种细胞毒性淋巴细胞，其细胞质中的小颗粒内含穿孔素和颗粒酶，能够杀伤病毒感染和癌细胞。NK细胞和T淋巴细胞一样，都由共同的淋巴样祖细胞发育而来，但NK细胞属于先天免疫系统。
约在20年前，NK细胞介导的免疫疗法已成为晚期白血病患者的一种安全有效的治疗方法。现在，基于NK细胞的癌症治疗领域已呈现出指数增长，成为免疫治疗创新的主要领域。不过，传统的NK细胞疗法也存在一些限制，为实现更广泛的临床转化，目前NK细胞定向疗法的发展有两个主要的重点：1.优化用于过继转移的治疗性NK细胞的来源；2.增强NK细胞的体内毒性和持久性。因此，确定优化这两个方面的方法具有重要的临床意义。目前各种来源的治疗性NK细胞正在临床上测试，包括半相合（haploidentical）NK细胞、CAR-NK细胞、干细胞来源的NK细胞、脐带血NK细胞、NK细胞系、适应性NK细胞和细胞因子诱导的记忆样NK细胞等。▲ 赛默飞针对CAR-NK的研究进程解析
同时，各种提高NK细胞效应功能的途径已经被开发，包括基因修饰的NK细胞正在被研究作为改善过继性NK细胞疗法抗肿瘤活性的手段，例如，CAR-NK细胞、具有修饰形式的CD16的NK细胞（例如Fate公司的FT516，在iPSC来源的NK细胞表面表达不可裂解的CD16 Fc受体，从而优化了ADCC）、和敲除CD38的NK细胞（可以在用针对该蛋白的单克隆抗体治疗期间预防中ADCC相关的自损伤）。在体内增强NK细胞治疗活性的辅助方法还包括，基于细胞因子的药剂（例如IL-12、IL-18和重组IL-15等），NK细胞衔接（engager）分子（例如TriKE，ROCK，NKCE和TriNKETs）和免疫检查点抑制剂等。嵌合抗原受体（CAR）技术赋予免疫效应细胞超强的抗肿瘤能力，给生物技术领域带来的前所未有的突破。除了当前炙手火热的CAR-T细胞，科学家也在不断探索多种免疫细胞类型，以达到更高的靶向性和更低的毒副作用。1) NK细胞具有MHC非限制性的抗肿瘤作用，可实现“现货型”；2) CAR-NK可以通过多种受体识别方式抑制癌细胞，灵敏度更高；3) NK细胞不会引发移植物抗宿主病（GvHD）、细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性等在CAR-T输注后常见的毒副作用；4) 由iPSCs分化而来的CAR-NK细胞可以批量化生产，提高效率的同时，能够实现细胞治疗的标准化和成本的降低。CAR-NK的研发一般包括以下几个步骤：1. CAR结构的设计、NK细胞制备；2. NK细胞的扩增、CAR转导，以制备CAR-NK；3. CAR表型鉴定和免疫分型的研究；4. CAR-NK 的扩增和功能分析；5. 建立动物模型进行临床前的体内评价。与CAR-T类似，对NK细胞进行基因工程的方法可以分为病毒类和非病毒类。病毒转导依赖于工程逆转录病毒载体或慢病毒载体将所需的基因结构送入细胞。非病毒转染技术包括电穿孔、CRISPR-Cas9、转座子等介导的方法。▲ CAR-NK生产过程概述
（图片来源：cancers）
通过电穿孔导入mRNA改造原代NK细胞来介导CAR的瞬时表达，是CAR-NK细胞疗法最常见的改造方法之一。赛默飞提供各种稳健的体外转录试剂盒帮助快速获得可靠的结果。
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▲mMESSAGE mMACHINE™ T7 ULTRA 转录试剂盒
2021年2月，中国国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）受理了国健呈诺生物科技（北京）有限公司针对晚期上皮性卵巢癌治疗的靶向间皮素（Mesothelin）CAR-NK产品的临床试验申请，这是国内首个获得CDE受理临床申报的CAR-NK产品，也是免疫细胞治疗实体瘤的重要里程碑。
由iPSC衍生出的NK细胞同时拥有外周血NK细胞和NK细胞系的优点，它性质均一，并且可以轻易地从皮肤或外周血中获取，一旦转化后便可在体外无限扩增，成为“即用型”CAR-NK细胞产品。对于人iPSC新型来源的免疫细胞，通常需要经过6个步骤，包括：供体细胞的培养、重编程（即将血细胞转变为iPSC的过程）、iPSC的扩增、iPSC基因改造、分化为CAR-NK的筛选和扩增、从基因和蛋白水平进行细胞鉴定。▲ 赛默飞CAR-NK解决方案
PrimeFlow™ RNA检测采用新型RNA原位杂交技术，结合bDNA专利技术，并利用流式细胞术分析RNA的表达。使用4种不同荧光染料的标记探针进行胞内的RNA原位杂交，同时兼容表面蛋白抗体染色，研究人员可利用流式细胞仪同时进行单细胞水平的RNA及蛋白表达的检测，是研究特定细胞，如CAR-T、CAR-NK或肿瘤细胞基因与蛋白表达水平的一个新型技术。
检测细胞亚群中的非编码RNA；
评估感染细胞中的病毒RNA；
如今，iPSC衍生的CAR-NK技术已在国内外纷纷步入临床阶段。Fate Therapeutics是利用iPSC分化免疫细胞进行肿瘤免疫治疗的先驱。2019年9月，Fate Therapeutics宣布美国FDA已经批准了其在研疗法FT596的IND申请。FT596源自克隆主诱导多能干细胞（iPSC）系，是该公司首个现货CAR-NK细胞免疫疗法，靶向多种肿瘤相关抗原。目前，FT596单药及联合CD20单抗治疗正在B细胞淋巴瘤（BCL）和慢性淋巴细胞白血病患者中进行1期临床研究。巨噬细胞（Macrophages）是先天性免疫的关键效应细胞，广泛分布在人体不同的器官组织中。其主要功能是对细胞残片、肿瘤细胞等起到吞噬作用。巨噬细胞也是一种高度异质性、具有可塑性和多能性的细胞群体，在体内外不同的微环境影响下，表现出明显的功能差异。根据活化状态和发挥功能的不同，巨噬细胞具有两种极化状态，分别是促炎、细胞毒性的M1表型和抗炎、促修复的M2表型。与T细胞相比，巨噬细胞不需要复杂的抗原识别机制，可以比较直接的吞噬并清除那些看似异常的细胞。除此之外，巨噬细胞在实体瘤中非常丰富，比例可以达到40-50%，T细胞浸润通常不到10%。当巨噬细胞被募集到肿瘤微环境中，它们会在一定条件下被转化为肿瘤相关巨噬细胞（TAM）。TAM不仅缺乏吞噬肿瘤细胞的功能，而且还在肿瘤的发生发展、侵袭转移、免疫逃避及其血管和淋巴管生成等过程中扮演着十分重要的角色。▲ 巨噬细胞和 TAM 的两个主要亚群
（图片来源：Frontiers in Oncology）
基于巨噬细胞的特性，研究人员也开发了靶向巨噬细胞的抗体药物，例如CD47抗体等。除此之外，基于巨噬细胞的细胞疗法也逐渐成为了热门的研发方向。鉴于CAR-T细胞疗法的成功，将CAR工程技术沿袭用于其他类型免疫细胞的工程化改造引起了研究者们极大的兴趣。
CAR是结合了抗体的特异性和细胞下游信号的工程化分子。通过对巨噬细胞进行基因工程改造以表达CAR，能使巨噬细胞更有效地靶向癌细胞，并逆转肿瘤抑制性微环境，以此突破免疫细胞疗法在实体瘤中的障碍。2020年7月27日，宾大科学家创立的Carisma Therapeutics宣布其先导药物靶向HER2的CT-0508获得FDA批准进入临床研究，成为首个进入临床的CAR-M疗法，用于治疗HER2阳性的实体瘤。今年3月， CT-0508完成了首例受试者给药，标志着巨噬细胞治疗实体瘤进入新纪元。 这款CAR-M的开发基于腺病毒载体转导，使巨噬细胞表达靶向Her2抗原CAR的同时，被激活分化成为促炎症的M1型巨噬细胞。因此，改造后的CAR-M细胞不仅能够靶向吞噬肿瘤细胞，还可以通过分泌促炎症细胞因子，改变肿瘤附近的微环境，同时将肿瘤抗原呈递给T细胞，激活T细胞对肿瘤的免疫应答。▲ CAR-M的作用机制
（图片来源：Carisma Therapeutics）
2020年11月11日，浙江大学医学院与药学院的科学家们在Journal of Hematology & Oncology杂志上发表标题为Pluripotent Stem Cell-derived CAR-Macrophage Cells with Antigen-dependent Anti-Cancer Cell Functions的文章，首次报道了基于诱导多能干细胞 （iPSC） 分化的表达嵌合抗原受体的巨噬细胞 （CAR-iMac） 在肿瘤的免疫细胞治疗中的潜在应用。▲ 图片来源：Journal of Hematology & Oncology
诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）由人体外周血单核细胞（hPBMC）经过重编程产生，具有分化成为多种体细胞的潜能，由于其来自患者本身、易于扩增、且具有单克隆基因修饰/编辑的便利性等优点。研究人员首先对iPSC进行CAR转导，然后将其分化为CAR-iMac；得到的CAR-iMac细胞不仅具有很高的产率（>50x） 和纯度（接近100% CD11b/CD14阳性），而且具有巨噬细胞的基因表达谱以及成熟巨噬细胞的吞噬、极化等功能。CAR-iMac细胞在小鼠的血液肿瘤和实体肿瘤模型中也展现出抑制肿瘤细胞生长的能力。▲ CAR-iMac的制备
（图片来源：Journal of Hematology & Oncology）
和我们熟知的T细胞受体（TCR）或基因工程改造表达嵌合抗原受体（CAR）的自体T细胞疗法一样，肿瘤浸润淋巴细胞TIL（Tumor infiltrating lymphocytes）治疗也是一种基于T细胞的过继性细胞疗法（ACT）。TIL细胞疗法从肿瘤组织中分离肿瘤浸润的淋巴细胞，在体外培养和大量扩增后回输到患者体内，是一种高度个性化的疗法。TIL疗法的效应细胞是经过天然选择与富集、肿瘤特异性T细胞比例高、多样性丰富的群体。与其它免疫疗法（例如，CAR-T、PD-1/PD-L1抗体）相比，TIL具有多靶点、肿瘤趋向和浸润能力强、副作用小等优势；是实体瘤治疗的理想选择，前景广阔。除此之外，成本方面，有业内专家预计，TIL疗法的价格约在7-8万美元，目前CAR-T细胞的价格均在数十万美元级别（Yescarta定价为37.3万美元）。传统TIL疗法存在着一定的局限性，包括：1. TIL大多数是耗竭性T细胞，杀伤功能相对较弱；2. TIL同样会被微环境抑制；3. TIL的大规模有效扩增也存在技术难点等。随着技术的不断升级， TIL疗法的应用性也正在逐步完善，为肿瘤细胞免疫治疗领域带来新的思路、开阔应用前景。近来，许多试验，包括TIL领域处于领先地位的Iovance公司，都已经将TIL输注与预处理和输注后方案结合起来，以控制宿主微环境，并促进治疗后TIL在体内的活化和增殖。输注前用化疗或全身放疗进行淋巴清除能够消除促进生长的细胞因子的竞争，并去除了抑制细胞（如Treg细胞和髓源抑制细胞），为后续新的细胞注入提供了先机。当IL-2与TIL联用时， IL-2能够增强TIL的扩增和活性来提高抗肿瘤反应，并有助于提高TIL疗效的持续性。不过，需要注意的是，高剂量的IL-2给药可能引起的多种毒性（例如，水肿，低血压等）。该方法包括从切除的肿瘤组织中收集和培养淋巴细胞，然后测试对特定新生抗原表位的反应性。利用荧光激活细胞分选（FACS）或磁珠（MACS）分选出能以高亲和力识别肿瘤抗原的淋巴细胞，随后离体扩增并重新注入患者体内。该方法的主要优点是对特定患者肿瘤的特异性强，但制造周期可能较长，约在10周左右。![]()
▲ TIL个性化富集流程
（图片来源：Frontiers in Immunology）
➤ 工程化改造TIL：改善细胞毒性，增强肿瘤归巢或减少T细胞衰竭从新鲜肿瘤片段中初步分离TIL后，可以利用逆转录病毒或慢病毒载体对TIL进行基因修饰。对于TIL的改造，增强细胞毒性、增强肿瘤归巢和减少T细胞衰竭是目前解决TIL疗法技术瓶颈的三种主要策略。▲ 合成TIL的策略
（图片来源：Frontiers in Oncology）
早在1986年，美国国家癌症研究所（NCI）的史蒂夫·罗森伯格（Steve Rosenberg）率先开发了TIL细胞疗法，最初用于治疗黑色素瘤。Iovance Biotherapeutics是TIL产业化的先行者，他们将Rosenberg实验室繁杂的TIL生产过程，变成了一个标准的工业化生产过程，并且证实了其工业化生产工艺能达到和实验室工艺同样的临床疗效。基本方法：技术人员将手术切除的肿瘤切碎，并将其置于含有生长因子的培养基中，生长因子通常是IL-2和CD3激动剂，以刺激T细胞增殖。扩增过程通常需要5到6周的时间来培养足够的细胞——高达500亿个——再回输至患者体内。这种T细胞可以非常长寿；在成功治疗的患者体内，能大量检测到这部分细胞长达五年。现在，研究人员还提高了他们收获和扩增T细胞的能力，并NCI和Iovance报道了从超过90％体积庞大的肿瘤中收获TIL的成功案例。▲ TIL的生产流程
（图片来源：Iovance Biotherapeutics）
用Invitrogen Dynabeads技术进行细胞分离当您想要分离高产量的、纯的功能性活细胞时，用Invitrogen Dynabeads磁珠进行温和的管式磁性分离是首选技术。磁性分离有助于确保分离的细胞不会承受因穿过致密的分离柱所带来的压力影响，并且细胞的自然特性得以保留。根据细胞分离策略不同可以分为以下三种分离方法：
在阳性细胞分离时，Dynabeads结合靶细胞，并将磁珠/细胞复合物拉到磁力架上。遗弃上清液，获得您的纯化目标细胞。完成细胞分离后，直接使用 Dynabeads FlowComp技术，可轻松释放和去除磁珠。
在阴性细胞分离时，使用提供的抗体混合物通过Dynabeads去除所有不需要的细胞。无磁珠和未结合的靶细胞仍残留在样本中，并可在流式细胞仪中进行直接分析，以及用于所有功能分析。
lovance公司的首个TIL产品Lifileucel（LN-144）预计将很快上市，不过，监管方面对于TIL的上市抱有谨慎态度十分谨慎的态度，Lifileucel针对晚期黑色素瘤的BLA申请已两次被FDA推迟（去年10月、今年5月），要求提供更多的CMC数据。除了Iovance公司，也有不少其他公司/机构正在积极布局针对各种实体瘤的TIL疗法，国内布局TIL治疗实体瘤的公司还有北京卡替医疗、君赛生物、西比曼生物等。医麦课堂携手全球科学服务的领导者Thermo Fisher Scientific（赛默飞世尔科技），在2021年第2季度上线“解码细胞免疫治疗，鼎力现在与未来”系列线上专题讲座（共四场）。在6月3日（周四）第四场系列公开课中，赛默飞世尔科技生命科学事业部 蛋白与细胞分析技术专家 马骏为我们带来了“CAR-NK细胞治疗产品研发流程解析”主题课程。课程中，马骏详细介绍了基于iPSC NK细胞来源的CAR-NK基本开发流程；分享了CAR-NK细胞表达鉴定、免疫分型及功能分析的方法；并提出3D细胞模型在CAR-NK应用前景。详细内容扫描下图二维码，进入课程回放。
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参考资料：
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Pfefferle, A. and Huntington, N., 2020. You Have Got a Fast CAR: Chimeric Antigen Receptor NK Cells in Cancer Therapy. Cancers, 12(3), p.706.Zhang, L., Tian, L., Dai, X., Yu, H., Wang, J., Lei, A., Zhao, W., Zhu, Y., Sun, Z., Zhang, H., Church, G., Huang, H., Weng, Q. and Zhang, J., 2020. Induced Pluripotent Stem Cell-derived CAR-Macrophage Cells with Antigen-dependent Anti-Cancer Cell Functions for Liquid and Solid Tumors.Jiménez-Reinoso, A., Nehme-Álvarez, D., Domínguez-Alonso, C. and Álvarez-Vallina, L., 2021. Synthetic TILs: Engineered Tumor-Infiltrating Lymphocytes With Improved Therapeutic Potential. Frontiers in Oncology, 10.Xiang, X., Wang, J., Lu, D. and Xu, X., 2021. Targeting tumor-associated macrophages to synergize tumor immunotherapy. Signal Transduction and Targeted Therapy, 6(1).Bianchi, V., Harari, A. and Coukos, G., 2020. Neoantigen-Specific Adoptive Cell Therapies for Cancer: Making T-Cell Products More Personal. Frontiers in Immunology, 11.
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