浅析AAV基因治疗的大规模生产工艺的现状
基因治疗领域经历了近 50 年的上下求索，在血友病等罕见性遗传性疾病的治疗中尽显风骚。然而基因治疗产品的工业化生产工艺以及生产规模的放大都面临诸多挑战。
8月17日医麦客诚邀宜明细胞董事长兼首席科学家孙秀莲博士与美国ASC Therapeutics创始人兼CEO姜儒鸿博士做客医麦客直播间，两位专家将分别为您剖析AAV基因药物商业化过程中的难点、痛点、解决方案以及AAV基因疗法在A型血友病中的产品研发的概况。基因治疗（gene therapy）是通过分子生物学技术，将目的基因递送至患者体内靶器官/细胞，纠正错误的基因表达，从根本治愈疾病。目前上市的基因治疗药物以及众多的候选药物主要针对罕见性遗传性疾病的患者群体，这是一个数以亿计的，几乎无药可医的群体。因此，无论药物开发者，还是患者群体都在大力推动这些基因治疗产品，希望新药快速完成开发周期并获得监管部门的批准。
药品研发必须考虑生产工艺的可扩展性以及成本。这对于AAV载体来说，情况尤为复杂。AAV载体包括衣壳蛋白以及衣壳内所携带的遗传物质，治疗过程中必须确保每个载体都有效地、准确地将遗传信息递送到靶细胞/器官，表达正确的蛋白，执行预期的功能，从而达到治疗效果。这是一个复杂的、多步骤的过程。另外AAV治疗本身具有多重特性，任何一个环节的变化都会影响到最终药效。因此对于这一复杂产品来说，产品的纯度、载体数量等都因具体的适应症、患者群体规模、给药途径和所需剂量而异。AAV的复杂性阻碍了其生产规模的升级/放大，成为AAV基因产品商业化进程中最大的瓶颈。我们将具体阐述AAV规模化生产的难点以及目前业界的解决方案。
高冷的学术出身
绝大多数用于基因治疗的AAV载体的生产工艺都源于实验室，需要大量手工操作， 然而这类劳动密集型工艺并不适合大规模的GMP生产，这就为AAV产品在商业化进程中的可扩展性(scalability)、可重现性(reproducibility)和可比性(comparability)埋下了隐患。
“实验室生产工艺”上游通常使用贴壁培养体系进行细胞培养，这一工艺无法扩大。下游通常使用超速离心技术进行纯化，这一方法亦不可扩大，而且后续检验也存在问题。另外，经超速离心纯化的产品实心率非常高，这也无法通过更可扩展的技术复制。
然而，这些不可扩展的生产工艺往往一直被持续应用，直至一期临床阶段。如果一期试验成功，那么研发者将面临两个非常严峻的问题，即如何转向一种可扩展的新工艺，稳定地为后期临床试验生产出所需的大量原料，直至进入市场（可扩展性）；如何在药物研发过程中确保产品在生产工艺变更前后质量的高度相似性（可比性）。
上游细胞培养以及转染的限制
目前最常用的AAV生产方法是在悬浮培养体系中应用三质粒体系的瞬时转染方法。该法方便快捷，而且适用于所有血清型的临床或商业产品，监管机构也普遍地接受了这种方法。
但瞬时转染方法仍然存在问题。首先，缺乏高产稳定的悬浮细胞系，目前市场上的细胞系由于易聚集性等问题导致病毒生产率很低。宜明细胞（Ubrigene）专有的293XS细胞系采用无血清悬浮培养体系培养 ，病毒产量可高达1E14 VG/L，细胞的密度可以达到1E7 cells/ml。其次，因为瞬时转染的固有性质，即随着规模的增加，其效率显著降低，AAV目前的生产规模只能达到200至500升，这远远低于单克隆抗体的商业化生产规模。
另外，病毒载体的产量和实心率会因其血清型、甚至转染目的基因不同而存在很大的差异。再者，质粒也是瞬时转染能否成功的决定因素。宜明细胞的高品质GMP质粒是大规模AAV生产的前提条件。宜明细胞的质粒发酵产量高达1g/L，创新开发的两步法纯化工艺在保证品质的同时提高下游得率达50-60%，为AAV的制备和成本降低奠定了基础。
下游分离纯化问题
目前AAV载体的下游纯化工艺多采用可扩展的色谱纯化法。但是，如何鉴定分离完整衣壳（有DNA）和空衣壳（没有DNA）仍然是行业的一个难点。由于给药剂量是基于病毒基因数目(viral genomes，vgs)，空衣壳的存在不仅增加了总体的病毒载量，还因为不携带目的基因而引发免疫原性。因为完整衣壳和空衣壳之间的电荷差异非常微妙，离子交换(ion exchange，IEX)色谱法也只能富集完整衣壳，而不能真正将两者分离。相比之下，超速离心法则可以更有效分离空衣壳，但是因其缺乏稳定的可扩展性，无法进行生产工艺的变更，不利于后期载体的大规模纯化 。
另外部分完整衣壳还可能包含截短的目的基因、宿主细胞DNA、质粒DNA和其他遗传物质，这些衣壳亚种的分离更是一个难点。不仅如此，因为目前缺乏高通量的、敏感准确的分析工具，很难鉴定空衣壳、部分完整衣壳和完整衣壳的产品表征。业界亟需一种改良的离子交换方法或其他突破性技术，真正地将空衣壳和部分的亚种从完整衣壳中分离出来。同样地，还需要高通量且敏感的分析工具来检测不同批次的完整衣壳/空衣壳/部分完整衣壳的差异，以便控制影响生产工艺的相关参数。
缺少适宜的分析工具
如前文所述，空壳率的检测一直是难点，目前精度较高的方法是应用分析型超速离心技术（AUC），AUC可以表征AAV病毒颗粒的特性，精准测定AAV病毒载体空壳率。在宜明细胞，AUC也是出产高品质AAV的关键检测手段。
事实上，在AAV的基因药物生产过程中，几乎所有步骤所面临的中心问题都是对于敏感准确的分析技术的需求。现有的分析方法仍在不断演变中。这些不稳定的分析方法，即使获得工业界的认可，也很难检测工艺变更对产品的影响，以及不同批次间的差异，这往往阻碍了必要的工艺变更。
产能问题
近年来，随着基因领域的日益繁荣，越来越多的基因治疗候选药物进入后期开发阶段，于是产能及其关键原料的获取已成为一个额外的问题。加之COVID-19的大流行，以及数十亿剂疫苗生产需求，更让这个问题雪上加霜。
病毒载体，质粒DNA和其他原材料(血清，转染试剂等) 的产能有限，一次性设备组件的交付时间长，经验丰富和熟练的专业人员有限，这些都阻碍了AAV基因治疗产品的开发进度。换言之，同时拥有AAV基因治疗开发、生产和测试专业知识的集大成者少之又少。因此大多数基因治疗公司更青睐于采取一种内部生产与外包生产（即CDMO服务）相结合的方式。这种混合方式适合管理管线以及有波动的原材料需求。
宜明细胞自2015年起就深度布局一站式基因药物CDMO市场，在济南和苏州建立了面积超10000平方米的GMP制备基地，拥有专有的、合规的、适用于规模化工业生产的技术平台，可为客户提供GMP级别的质粒、AAV、腺病毒、慢病毒以及CAR-T等CDMO生产服务，以满足客户早期研发、新药临床试验申报（IND）、临床试验以及商业化生产的要求。
济南基地↓
苏州基地↓
解决方案
尽管不如传统生物医药生产工艺成熟，今天AAV的生产工艺较之以往已经有了显著的进步和改善，当前的重点是使之更适合GMP生产、以及大规模和商业化生产。
昆虫杆状病毒表达载体系统(BEVS)与1型人源单纯疱疹病毒(HSV)系统的共感染方法比瞬时转染更具有可扩展性，可以达到2000L的生产规模。此外，这一方法通常可以显著提高产量以及实心率，这也使得IEX纯化方法有了用武之力。不过，这种方法也有其局限性。首先共感染方法需要重组病毒库存，这一般需要一年的时间，无疑增加了时间成本。此外，BEVS仅对1～2种AAV血清型具有高传染性，且出产的产品质量不稳定。另值得注意的是HSV是一种大型包膜病毒，其自身的生产就很有挑战性。如何控制HSV生产平台所产生的不同的残留物，以确保不会影响患者的免疫反应，也是不容忽视的问题。
另外就是建立包装/生产细胞系，基于包装/生产细胞系的生产工艺不受转染性质的限制，提供了更多的可扩展性。AAV载体的包装/生产细胞的设计是非常复杂，需要在细胞中植入一个开关关闭病毒蛋白，并在“正确时刻”开启，以防止有细胞毒性的病毒蛋白对细胞的毒害。目前，这类开关往往依赖于抗生素或病毒。但是，一些“漏网之鱼”会产生的较低水平的病毒蛋白，不利于健康细胞的扩增。即便如此，包装/生产细胞系依然不失为一个加速上市进程的颇具吸引力的选择。
下游分离纯化问题已在上文阐述。IEX色谱纯化法比超速离心法更具有可扩展性，但在某些情况下，超速离心法也是不可避免的。在不造成大量产品损失的情况下，以可扩展和可复制的方式真正地分离完整衣壳仍然是业界一个长期目标。
总之，基因疗法开发的长期成功取决于能否建立可扩展的、商业上可行的制造工艺。作为一个行业，必须推动可扩展的以及成本效益更高的生产工艺，研发患者负担得起的基因药物。本文作者：Dr.Yang
2.https://www.contractpharma.com/issues/2021-05-01/view_features/overcoming-aav-manufacturing-challenges/
3.https://mp.weixin.qq.com/s/SzFM7Z1xXR3r_HwnOT4JtQ
宜明细胞由国际知名专家打造，专注于临床级病毒载体的开发和生产，服务产品有GMP级质粒、AAV、慢病毒、腺病毒、CAR-T及IND申报资料等。宜明细胞定位于生物与健康产业，全面满足客户的早期药物研发、临床试验、大规模商业化生产的需求，为细胞及基因治疗药物开发企业提供一站式CDMO整体解决方案。
非注册临床研究用质粒和病毒开发、生产（IIT）
基因治疗新药临床申报质粒和病毒开发、生产（IND）
基因治疗临床样品及商业化GMP生产
周期短：成熟的平台工艺，几十批次GMP产品生产经验。
标准高：完善的质控体系，全面符合基因药物申报标准。
产能高：质粒载体发酵规模可达200L；悬浮细胞培养最大规模为500L。
成本低：先进的纯化工艺，得率高，有效控制成本。
专业强：国际知名专家团队，核心人员10年+行业经验。
更安全：C+A洁净标准，全封闭A级隔离器生产、灌装。
更广泛：基因药物从IIT、IND到商业化GMP生产的综合服务。